馬拉硫磷降解菌研究初報

摘要：試驗從延安寶塔區和安塞縣等地長期噴施馬拉硫磷的土壤中分離得到１５株可降解馬拉硫磷的菌株，其中菌株ＭＮ－１３在３２ ℃、馬拉硫磷濃度為２．０ ｍＬ／Ｌ、第六天時，對馬拉硫磷的降解率最高，可達９２．３０％，馬拉硫磷的轉化與該菌株的生長規律存在相關性。

關鍵詞：馬拉硫磷；降解；菌株

中圖分類號：S154.3文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3708-03

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｍａｌａｔｈｉｏｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎｓ

ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＭＡ Ｎａ－ｎａ，ＹＡＮＧ Ｊｉａ－ｊｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎ’ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎ’ａｎ ７１６０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｉｆｔｅｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ that ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄａｔｅ ｍａｌａｔｈｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ which had been ｓｐｒａｙed ｍａｌａｔｈｉｏｎ for a ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ． Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｎ （ＭＮ－１３） ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ （９２．３０％） ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ３２ ℃， ｍａｌａｔｈｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２．０ ｍＬ／Ｌ． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌａｔｈｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： malathion； degradation； stain

馬拉硫磷又名四零四九，屬低毒殺蟲劑，具有良好的觸殺和一定的熏蒸作用，在農業生產中普遍使用，近年來馬拉硫磷的產量和使用量劇增，引發的環境問題令人擔憂。大量使用的難降解農藥在土壤中不斷積累，殘留農藥經過植物進入食物鏈后最終在人體內富集，給人類造成嚴重的危害［１－４］。目前我國受殘留農藥污染的土地面積大，傳統的化學處理方法費用高且會造成新的污染，如何利用微生物的強大分解作用來降解土壤中的殘留農藥，對改善農產品的品質、提高人民生活水平具有重大的研究價值。我們從陜北長期使用馬拉硫磷的土壤中篩選得到可以降解馬拉硫磷的菌株，對其降解性能進行了研究，以期為該類農藥殘留的生物降解提供科學方法。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試土樣采自延安寶塔區和安塞縣長期噴施馬拉硫磷的田地。

１．１．２培養基ＬＢ培養基、馬拉硫磷無機鹽培養基［３］：ＮａＮＯ３ ２．０0 ｇ、ＫＣｌ ０．５０ ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０２ ｇ、ＣａＣｌ２ ０．０４ ｇ、馬拉硫磷（馬拉硫磷濃度可根據需要調整）、去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ值６．５。

１．１．３供試農藥、試劑和儀器供試農藥：２５％馬拉硫磷乳油（廣西禾泰農藥有限責任公司）。試劑：鉬酸銨（分析純，南京化學試劑有限公司）、氯化亞錫（分析純，如皋市天成化工有限公司）、Ｐ２Ｏ５（分析純，南京化學試劑有限公司）等。儀器：隔水式電熱恒溫培養箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０×５０－ＢＳ，上海躍進醫療器械廠）、紫外分光光度計（ＵＶ－１２４０，日本島津）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江陰濱江醫療儀器廠）。

１．２方法

１．２．１馬拉硫磷降解菌的篩選［５－１１］

１）富集。常規方法在選取的采樣點采集土樣、混勻，制成菌懸液，無菌操作接種于ＬＢ培養基中，３２ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培養３ ｄ。

２）初篩。將富集得到的菌液以５％的接種量接種到馬拉硫磷無機鹽培養基中（馬拉硫磷濃度依次為０．５、１．０、１．５、２．０ ｍＬ／Ｌ），３２℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培養１６ ｄ，取最后一次培養的菌液涂布于ＬＢ平板上，劃線分離得到單菌落，轉管保藏于４℃冰箱備用。

３）復篩。將保存的菌株接到液體馬拉硫磷無機鹽培養基中，３２ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培養２４ ｈ，測定ＯＤ６００。選出生長情況好的菌株作為下一步的試驗菌株。

１．２．２馬拉硫磷降解率的測定

１）無機磷標準曲線的繪制。無機磷標準曲線的繪制利用磷鉬藍比色法［１２］，以無機磷濃度為橫坐標，以ＯＤ６９０為縱坐標，繪制磷標準曲線。

２）馬拉硫磷降解率的測定。對復篩得到的菌株接種到ＬＢ液體培養基中，３２ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培養，２ ｄ后以５％的接種量接種到馬拉硫磷濃度為２．０ ｍＬ／Ｌ的無機鹽培養基中， ３２ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培養７ ｄ，以不加菌的馬拉硫磷培養基作空白對照。從０ ｈ開始，每隔２４ ｈ取樣一次，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，取上清液用磷鉬藍顯色法［１２］測定樣品的ＯＤ６９０，和無機磷標準曲線相結合，得到培養液中的無機磷，利用公式計算出各試驗菌株對馬拉硫磷的降解率。

試驗菌株對馬拉硫磷降解率＝［（ｘ０－ｘ１）/（ｘ２－ｘ１）］×１００％

式中：ｘ０為試驗組培養液中無機磷含量，ｘ１為對照組培養液中無機磷含量，ｘ２為培養液中最初的有機磷含量。

２結果與分析

２．１馬拉硫磷降解菌篩選結果

通過富集、初篩，共得到純菌株３６株（分別編號為ＭＮ－１至ＭＮ－３６），經過在馬拉硫磷無機鹽培養基中培養２４ ｈ后，各菌株的ＯＤ６００都有不同程度的增加，其中生長情況較好、ＯＤ６００高于０．６的共有１５株，結果如圖１所示。由圖１可知，３６株菌中，有１５株可以在馬拉硫磷無機鹽培養基中進行生長，其中菌株ＭＮ－９、ＭＮ－１０、ＭＮ－１３、ＭＮ－２６生長情況最好，將這４株菌作為下一步的試驗菌株。

２．２馬拉硫磷降解菌的降解性能的測定結果

為了進一步研究試驗菌株在馬拉硫磷無機鹽培養基中的生長機理，即菌體是否在馬拉硫磷無機鹽培養基中進行生長，同時將馬拉硫磷中的有機磷轉化為無機磷，完成對殘留馬拉硫磷的解毒作用。利用磷鉬藍比色對試驗菌株生長過程中無機磷的增加量進行了檢測。

２．２．１無機磷標準曲線的繪制結果以無機磷濃度為橫坐標、以ＯＤ６９０為縱坐標，繪制出的無機磷標準曲線見圖２。

２．２．２試驗菌株對馬拉硫磷降解率的測定結果將試驗菌株在ＬＢ培養基中活化后，接種到馬拉硫磷無機鹽培養基中，以培養時間為橫坐標，以馬拉硫磷降解率為縱坐標，得到試驗菌株在培養的不同時段對馬拉硫磷的降解情況如圖３。

由圖３可知，４株試驗菌株在同一時刻對馬拉硫磷有不同的降解率，其中MN-13的降解率可達92.30%。同一株菌對馬拉硫磷的降解率也隨時間的變化而變化，具體而言，對照組的有機磷隨著時間的推移也在緩慢減少、轉化為無機磷，這可能是由于自然光解作用，使得部分有機磷毒性降低，發生了轉化；４株試驗菌株的降解率的變化趨勢為：在１～２ ｄ內，試驗組和對照組沒有明顯區別，在３～６ ｄ內，降解率迅速升高，MN-9菌株從第五天開始，其余菌株從第六天開始，降解率略有下降。其原因可能是，根據微生物的生長規律，１～２ ｄ內，試驗菌株處于生長的遲緩期，是適應新環境的過程，并未大量生長，因此降解曲線和對照組幾乎相一致。兩天后，細菌適應了新的環境，開始生長，因此對馬拉硫磷的降解率開始增加，到４～６ ｄ內，進入對數期快速生長，使得降解率迅速升高，并達到最大值。第五天或第六天以后，細菌開始衰亡，生長能力開始下降，部分菌體自溶，對馬拉硫磷的降解能力開始下降，由此說明馬拉硫磷的轉化與細菌的生長規律有一定的相關性。

３結論與討論

１）試驗菌株ＭＮ－１３在３２ ℃、６ ｄ時，對馬拉硫磷的降解率達９２．３０％，從而得到一株能夠高效降解馬拉硫磷的菌株，為今后利用微生物降低農藥殘留的技術推廣應用打下了基礎。

２）菌株在降解馬拉硫磷的過程中，受到溫度、溶氧、馬拉硫磷初始濃度、接種量、時間、ｐＨ值等諸多因素的影響，此次試驗以選定的溫度（３２ ℃）、馬拉硫磷初始濃度（２．０ ｍＬ／Ｌ）、接種量（５％）、ｐＨ值（６．５）進行研究，相關因素的優化有待于進一步研究。

３）馬拉硫磷降解菌是以馬拉硫磷作為碳源，通過礦化作用，將農藥中的有機磷轉化為無機磷，而使農藥降低（失去）毒性，無機磷還可以被植物吸收，滿足生長的需要，達到減毒和促生長的雙重功效，這是傳統的化學處理法不能相比的。

４）不同的菌株在同一時間對馬拉硫磷有不同的降解率，同一菌株在不同的時間對馬拉硫磷的降解率也不同，可能是由于菌株對于馬拉硫磷的轉化是與菌體的生命活動相關聯的，即馬拉硫磷是在菌體的代謝過程中被轉化的。

５）有研究報道，某些有機磷農藥降解菌的基因在質粒上［１３］。因此，菌株ＭＮ－１３降解馬拉硫磷的相關基因及其與其他有機磷農藥的微生物降解之間的關系有待于進一步研究。

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