一株產(chǎn)甘草酸內(nèi)生真菌的分離及代謝產(chǎn)物分析

摘要：采用組織塊法從采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市的甘草根部分離純化內(nèi)生真菌，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，抽提發(fā)酵粗產(chǎn)物，以甘草酸為標準品采用LC-MS法和ＨＰＬＣ法對這些真菌的代謝產(chǎn)物進行篩選，獲得１株產(chǎn)甘草酸的內(nèi)生菌，通過形態(tài)學研究初步確定該菌株為鐮孢霉屬。

關(guān)鍵詞：甘草；內(nèi)生菌；甘草酸

中圖分類號：Ｑ９４９．３２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2841-03

Isolation of an Glycyrrhizic Acid-producing Andophytic Fungus from Licorice and Analysis of Metabolites

ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ，ＬＩ Ｙａ－ｌｉ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ endophytic fungi ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ the rats of ｌｉｃｏｒｉｃｅ in Erdos city of ｔｈｅ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ by tissue culture method．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ． Ｔｈｅ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ extract and ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＬＣ－ＭＳ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｂ１２ that was found as the glycyrrhizic acid-producing andophytic fungus ｗａｓ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｃｏｒｉｃｅ； endophytic fungi； ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ

內(nèi)生真菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ）是指生活在健康植物組織內(nèi)部，但不引起植物病害的真菌。不僅能夠參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成和轉(zhuǎn)化，還能獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源和具有高度開發(fā)價值的新型生物資源。自從１９９３年Ｓｔｉｅｒｌｅ等［1］首次報道了從太平洋紫杉樹中分離出一種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，許多研究者在多種植物中分離到了能產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性代謝產(chǎn)物的內(nèi)生菌。迄今為止，已從夾竹桃科、小檗科、杜仲科、禾本科、紅豆杉科等多年生藥用植物內(nèi)生真菌中分離到多種活性物質(zhì)［２］。甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ Ｂａｔ．）為豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）多年生草本植物，以干燥的根及根狀莖入藥。主要有效成分甘草酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ）為五環(huán)三萜皂甙化合物，不僅具有增甜、增香和增加風味的作用，而且還具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒包括抗肝炎病毒、抗艾滋病（ＡＩＤＳ）病毒和抗單純皰疹病毒等作用，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品等領(lǐng)域。由于甘草酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無法人工合成，甘草酸的獲得只能從甘草根中提取，而野生甘草資源已近枯竭，人工種植周期過長、組織培養(yǎng)技術(shù)目前實現(xiàn)甘草酸的工業(yè)化生產(chǎn)還比較困難，因此篩選和利用內(nèi)生菌來生產(chǎn)甘草酸有可能是一種全新的選擇［３］。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１甘草樣品在內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗梁外甘草標準化示范區(qū)采集甘草完整植株，隨機選取根部裝入滅菌紙袋內(nèi)編號備用。

１．１．２培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（ＰＤＡ）：馬鈴薯２００．０ ｇ，葡萄糖２０.0 ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，瓊脂１５．０～２０．０ ｇ，加水定容到

１ ０００ ｍＬ，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，去瓊脂為液體培養(yǎng)基。查氏培養(yǎng)基：ＮａＮＯ３ ２．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，蔗糖３０．００ ｇ， 瓊脂１５．０～２０．０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ，１×１０５ Ｐａ滅菌３０ ｍｉｎ。

１．１．３主要試劑和儀器甘草酸標準品購自阿拉丁試劑（中國）有限公司，純度＞９９．０％（ＨＰＬＣ）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，均購自國藥集團上海化學試劑廠。高速冷凍離心機ＴＧＬ－１６Ｇ（上海安亭科學儀器廠），低速臺式離心機ＴＤＬ－５Ａ（上海安亭科學儀器廠），Ａｇｉｌｅｎｔ－１１００高效液相色譜儀（美國Ａｇｉｌｅｎｔ公司）。

１．２方法

１．２．１甘草樣品預(yù)處理用無菌水洗凈甘草的根表面，無菌刀剝?nèi)ネ馄ぃ?nèi)皮和韌皮部，同時剪成０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ的小塊，用７５％乙醇浸泡５～１０ ｍｉｎ表面消毒，然后用無菌水沖洗５ｍｉｎ去除表面消毒劑，再用０．５２５％ ＮａＯＣｌ浸泡７ ｍｉｎ，無菌水沖洗５次，無菌濾紙吸干水分［４］。

１．２．２內(nèi)生真菌的分離和純化經(jīng)過預(yù)處理的材料接種于ＰＤＡ固體培養(yǎng)基上，２５ ℃培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取不同形態(tài)菌絲，接種于新鮮ＰＤＡ培養(yǎng)基上，培養(yǎng)３～５ ｄ后，再挑取菌絲分離單個菌落，如此反復(fù)純化多次，得到純化菌株［５］。

１．２．３內(nèi)生真菌形態(tài)觀察將純化培養(yǎng)物接種到查氏培養(yǎng)基上，２８ °Ｃ下倒置培養(yǎng)，待剛長出菌絲時，將無菌的蓋玻片斜插入平板內(nèi)（插片法），繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲爬滿蓋玻片，將玻片取出，在顯微鏡下觀察其特征。根據(jù)形態(tài)學特征，包括菌落的生長速度、菌絲體以及孢子的特征、分泌色素等，參照絲狀真菌的分類鑒定方法將上述真菌菌株鑒定到適當?shù)膶伲郏担荨?/p>

１．２．４內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)將分離純化的菌株接入２５０ ｍＬ三角瓶中（含ＰＤＡ液體培養(yǎng)基５０ ｍＬ），２５ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ發(fā)酵培養(yǎng)７ ｄ。

１．２．５發(fā)酵產(chǎn)物的提取發(fā)酵結(jié)束后真空抽濾，分別收集濾液和菌絲體。濾液用等體積的二氯甲烷萃取３次，合并上層有機相；菌絲體凍融后充分研磨，加入３０ ｍＬ乙酸乙酯，超聲萃取１５ ｍｉｎ，有機相與前述有機相合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上３５℃去除有機溶劑，得到的萃取物溶于１ ｍＬ甲醇中，供檢測用［６］。

１．２．６ＨＰＬＣ檢測色譜條件：色譜柱為Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８；流動相為甲醇－０．２ ｍｏｌ／Ｌ 醋酸銨溶液－冰醋酸（６７∶３３∶１）；流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長為２５１ｎｍ；柱溫為３０ ℃；進樣量為１０ μＬ。

精密稱取甘草酸標準品２ ｍｇ，甲醇定容至１０ ｍＬ，得母液濃度為０．２ ｍｇ／ｍＬ，將母液依次稀釋成濃度梯度為０．１０、０．０８、０．０４、０．０２和０．０１ ｍｇ／ｍＬ，取１０ μＬ進樣（ｎ＝５），得回歸方程為＝５．０６１ ４ｘ－４５．６７８ ０，ｒ２＝０．９９８ ５。建立標準曲線，將標準品和樣品分別進行ＨＰＬＣ分析［７－９］。

１．２．７ＬＣ－ＭＳ檢測液質(zhì)聯(lián)用儀條件：以甲醇∶水＝７０∶３０為流動相，流速０．３ ｍＬ／ｍｉｎ，紫外檢測波長２５１ ｎｍ，柱溫３０ ℃，進樣量１０ μＬ。電離源：電噴霧電離源（ＥＳＩ），毛細管電壓為３ｋＶ，錐孔電壓為２０ Ｖ，源溫為１００ ℃，脫溶劑氣溫度為３００ ℃，掃描范圍為９０～８００Ｄ。

２結(jié)果與分析

２．１菌種分離

從甘草根部共獲得了３６株單一的絲狀真菌。其主要分離部位為韌皮部，因植物材料表面嚴格消毒并整個過程在超凈工作臺中進行無菌操作，故上述純化菌株均可確認為是甘草的內(nèi)生真菌。

２．２ＨＰＬＣ檢測結(jié)果

ＨＰＬＣ分析結(jié)果（圖１）表明，標準甘草酸的保留時間為５．１８５ ｍｉｎ，而與之相似的是菌株Ｂ１２發(fā)酵純化產(chǎn)物的保留時間為５．２０7 ｍｉｎ。由此可以初步判斷菌株Ｂ１２發(fā)酵純化產(chǎn)物與標準甘草酸峰為同一物質(zhì)。

２．３ＬＣ－ＭＳ分析

在液質(zhì)聯(lián)用分析中，甘草酸標準品產(chǎn)生一個ｍ／ｚ為８２１．５的離子峰和一個ｍ／ｚ為８４３．５的離子峰（圖２），菌株Ｂ１２發(fā)酵純化產(chǎn)物也產(chǎn)生一個ｍ／ｚ為８２１．５的離子峰和一個ｍ／ｚ為８４３．５的離子峰。結(jié)果表明，甘草酸標準品和發(fā)酵純化產(chǎn)物的LC-MS圖譜基本一致，其中８２１．５和８４３．５處的兩離子峰是甘草酸分子的［Ｍ-Ｈ］-和［Ｍ－Ｈ＋Ｎａ］-，因而可以說明菌株Ｂ１２發(fā)酵純化產(chǎn)物中含有甘草酸。

２．４甘草酸的含量測定結(jié)果

精密稱取甘草酸標準品１ ｍｇ，甲醇定容至１０ ｍＬ，得母液濃度為０．１ ｍｇ／ｍＬ，取配置好的甘草酸標準品溶液以無水甲醇稀釋，分別配制成１０、５０、１００、２００、１ ０００ μｇ／ｍＬ的標準品溶液，搖勻，得系列濃度對照品標準溶液。分別精取上述對照品溶液各１０ μL在設(shè)定好的色譜條件下在高效液相色譜下進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，相應(yīng)的濃度為橫坐標，得標準曲線方程為＝５．０６１ ４ｘ－４５．６７８ ０，ｒ２＝０．９９８ ５，將樣品進樣所得峰面積代入方程得甘草酸產(chǎn)量為３４６．１ μｇ／Ｌ。

２．５內(nèi)生真菌形態(tài)特征及分類

從已分離純化的菌株中獲得４株可以產(chǎn)甘草酸的內(nèi)生真菌，其中編號為Ｂ１２的菌株在查氏培養(yǎng)基上生長較快，２８ °Ｃ培養(yǎng)７ ｄ，初期為短絨狀菌絲，逐漸向培養(yǎng)皿四周生長，后期菌落中央顏色變深，深色部分為分生孢子團，白色部分即分生孢子團邊緣圍繞的無色菌絲（圖３）。菌絲呈棉絮狀至絨毛狀，最初白色，后期逐漸變灰黑，培養(yǎng)基反面暗色；菌絲有隔、分枝、透明，直徑１．５～３．５ μｍ。根據(jù)該菌株的形態(tài)學特征，查閱相關(guān)文獻與鐮孢霉屬（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）的分類特征基本一致，菌株Ｂ１２暫定為鐮孢霉屬。

３小結(jié)與討論

在長期的共生環(huán)境中，內(nèi)生真菌和宿主植物相互作用，建立了平衡關(guān)系，在植物體內(nèi)形成相對穩(wěn)定的真菌菌群，為此很可能獲得了相關(guān)基因的直接傳遞，能產(chǎn)生與宿主相同的成分。藥用植物中的內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，可以產(chǎn)生與宿主相同的在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等行業(yè)有重要應(yīng)用價值的活性物質(zhì)。利用內(nèi)生真菌發(fā)酵實現(xiàn)生物活性物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，可以提高產(chǎn)量、降低產(chǎn)品成本，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求；同時有利于珍稀、瀕危藥用植物資源的保護，減少野生藥用植物多樣性的破壞。

研究從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗采得的甘草中分離得到一株產(chǎn)甘草酸內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學特征研究分析，初步鑒定該菌株為鐮孢霉屬。通過ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳ分別對菌株Ｂ１２發(fā)酵產(chǎn)物進行分析檢測，確定其產(chǎn)甘草酸，產(chǎn)量為３４６．１ μｇ／Ｌ，和已報道的甘草酸生產(chǎn)真菌相比，該菌株產(chǎn)量較高。目前已報道的內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)量均比較低，通過分離篩選高產(chǎn)量的菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，對菌株進行誘變育種等方式有望提高產(chǎn)量。該菌株在ＰＤＡ液體培養(yǎng)基中生長較快、產(chǎn)率穩(wěn)定，有利于通過馴化、誘變育種及優(yōu)化發(fā)酵條件來提高甘草酸的含量，以達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文