根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米萌動(dòng)胚ＮPR1基因遺傳轉(zhuǎn)化

摘要：以玉米萌動(dòng)胚為外植體，研究了影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米ＮＰＲ１基因遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素。結(jié)果表明，在感染液和共培養(yǎng)基中分別都加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，根癌農(nóng)桿菌ＬＢＡ４４０４的菌液，浸染時(shí)間１２ ｈ，４０ ｍｇ／Ｌ潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化苗篩選，為轉(zhuǎn)化的適宜條件。對(duì)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行ＰＣＲ檢測，證明外源目的基因已整合到玉米基因組中。

關(guān)鍵詞：玉米；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化；ＮＰＲ１基因；萌動(dòng)胚

中圖分類號(hào)：Ｓ５１３；Ｑ７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）14－2985-03

Genetic Transformation of NPR1 Gene to Germinating Embryo of Maize by Agrobacterium tumefaciens

ＱＩＮ Ｘｉｎ－ｍｉｎ，ＺＥＮＧ Ｄｅ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｈｕｉ－ｍｉｎ，ＱＩＮ Ｐｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｇｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １００ μｍｏｌ／Ｌ； ＯＤ６００ｎｍ ｏｆ ＬＢＡ４４０４ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｑｕｏｒｗａｓ ０．６； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ １２ ｈ； ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ １６ ｈ ａｔ ２６ ℃， ｕｓｅ ４０ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ． ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ； Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ

玉米是世界重要的糧食作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻居第三位，但產(chǎn)量卻居世界第一。在玉米栽培過程中病害嚴(yán)重，如大小斑病、青枯病、病毒病、銹病等嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，生產(chǎn)上亟需優(yōu)良抗病的玉米品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是培育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)品種的有效途徑之一。

ＮＰＲ１基因是植物系統(tǒng)獲得性抗性中的一個(gè)關(guān)鍵基因，它可調(diào)控植物的廣譜性抗性的發(fā)生，在植物系統(tǒng)性抗病中起著關(guān)鍵的作用［１］。ＮＰＲ１基因的表達(dá)可導(dǎo)致下游抗病基因的一系列反應(yīng)，從而賦予植株對(duì)細(xì)菌病原體和真菌病原體的抗性，即使ＮＰＲ１基因過量表達(dá)也只是提高了植物的抗病性，并無其他的不良反應(yīng)［２］。ＮＰＲ１基因功能是通過將克隆的野生型ＮＰＲ１基因轉(zhuǎn)化到擬南芥ＮＰＲ１基因突變體中，恢復(fù)了突變體抵抗Ｐseudomonas ｓｙｒｉｎｇａｅ和Ｐhytophthora ｐａｒａｓｉｔｉｃａ的能力［３］來證實(shí)的。Ｃｈｅｒｎ等［４］在通過讓水稻過量表達(dá)擬南芥ＮＰＲ１基因的實(shí)驗(yàn)來確定ＮＰＲ１基因在單子葉植物中所扮演的角色時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出對(duì)Ｘｏｏ（一種水稻細(xì)菌性枯葉病原體）的抗性提高，首次證明了ＮＰＲ１基因可以提高單子葉植物的抗病性。因此，ＮＰＲ１基因作為植物廣譜抗病性基因日漸受到人們的關(guān)注。

利用構(gòu)建的ＮＰＲ１基因表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，以玉米成熟萌動(dòng)胚為轉(zhuǎn)化受體，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分子檢測證明外源ＮＰＲ１抗病基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因玉米的基因組中。

１材料與方法

１．１材料

根癌農(nóng)桿菌為ＬＢＡ４４０４，所用的植物表達(dá)載體為ｐＣａＭＶＮＰＲ（帶有ＮＰＲ１基因和選擇性標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因［５］）。實(shí)驗(yàn)材料為玉米自交系７２３９。

１．２方法

１．２．１種子處理參照王昌濤等人的方法［６］并稍加改進(jìn)。玉米種子用自來水沖洗干凈，將種子浸泡在無菌水中，置于３７ ℃、４～５ ｈ，用體積分?jǐn)?shù)為７０％的酒精浸泡種子１ ｍｉｎ，１ ｇ／Ｌ升汞消毒８ ｍｉｎ，無菌水沖洗４次，超凈臺(tái)上用解剖刀在玉米胚上縱向劃開１～３ ｍｍ深的口子，然后將種子浸泡在無菌水中。

１．２．２根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化與抗性植株的篩選

１）感染液制備。平板上挑根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于５ ｍＬ ＹＥＢ培養(yǎng)液中（含５０ ｍｇ／Ｌ利福平，２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素），２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集菌體，加入５０ ｍＬ新鮮ＹＥＢ液體培養(yǎng)基（含１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮）繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

２）浸染轉(zhuǎn)化。將準(zhǔn)備好的玉米萌動(dòng)胚放入上述根癌農(nóng)桿菌液中，２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ繼續(xù)振蕩１２～２４ ｈ，然后把種子放在ＭＳ固體培養(yǎng)基上，黑暗共培養(yǎng)３ ｄ。

３）抗性苗的篩選。將共培養(yǎng)后的玉米種子在超凈臺(tái)上用無菌水沖洗４次，將大部分根癌農(nóng)桿菌除去，再轉(zhuǎn)入帶有潮霉素的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)篩選。

４）抗性苗的移栽。７～１０ ｄ后將根系發(fā)達(dá)、生長正常的綠苗取出，用自來水將根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽到通氣、保水良好的基質(zhì)中，用薄膜遮蓋，注意保濕，防止小苗過度失水。

１．２．３轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測從生長到１ ｍ高左右的抗性植株和未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株取葉片，用ＣＴＡＢ法［７］提取總ＤＮＡ作為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。ＰＣＲ引物Ｐ１和Ｐ２由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Ｐ１：５′－ＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＴＧＡＴ

ＴＡＧＣＡＧ－３′；Ｐ２：５′－ＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＡ

ＡＧＡＧＧＣＡＡＧ－３′。

３０ μＬ ＰＣＲ反應(yīng)體系：模板ＤＮＡ ３０ ｎｇ，上下游引物各０．５ μｍｏｌ，４種ｄＮＴＰ各１００ μｍｏｌ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ ３ μＬ，Ｔａｑ酶２．５ Ｕ。反應(yīng)程序?yàn)椋梗?℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ、５５ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳，ＥＢ染色后觀察擴(kuò)增結(jié)果并照相。

２結(jié)果與分析

２．１影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚的因素

２．１．１消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響采用１ ｇ／Ｌ升汞，比較了６、８、１０、１２ ｍｉｎ消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間８ ｍｉｎ較為適宜（基本沒有污染，萌發(fā)率在８５％以上），低于８ ｍｉｎ，玉米種子在隨后的實(shí)驗(yàn)中，污染率較高。高于８ ｍｉｎ，隨著消毒時(shí)間的延長，種子的萌發(fā)率會(huì)明顯下降，１２ ｍｉｎ萌發(fā)率僅為６０％左右。可能是玉米種子經(jīng)過３７ ℃水浴４～５ ｈ后已經(jīng)開始萌發(fā)，對(duì)消毒劑比較敏感所致。

２．１．２潮霉素篩選濃度的確定實(shí)驗(yàn)使用的植物表達(dá)載體ｐＣａＭＶＮＰＲ的Ｔ－ＤＮＡ區(qū)含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，因此用不同濃度潮霉素進(jìn)行了抗性篩選實(shí)驗(yàn)。潮霉素濃度太低容易出現(xiàn)假陽性植株，過高則影響植物正常生長發(fā)育。分別選擇含有０、２５、５０、７５、１００、１２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素的ＭＳ培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基中接種１００粒玉米種子，進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，重復(fù)３次。從表１可以看出，當(dāng)潮霉素濃度高于５０ ｍｇ／Ｌ時(shí)，基本上玉米種子都喪失了發(fā)芽能力，選擇了４０ ｍｇ／Ｌ作為抗性篩選濃度，這樣既可避免假陽性植株的再生，又可使抗性植株正常生長（圖１）。

２．１．３浸染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響分別采用４、８、１２、１６、２４ ｈ浸染玉米萌動(dòng)胚，經(jīng)共培養(yǎng)和抗性篩選后統(tǒng)計(jì)抗性植株數(shù)。從表２可以看出浸染時(shí)間是影響抗性植株數(shù)即轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素。浸染時(shí)間過長過短都不利于萌動(dòng)胚的轉(zhuǎn)化，浸染１２ ｈ轉(zhuǎn)化率最高（表２）。

２．１．４乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響設(shè)計(jì)了４個(gè)處理：①不加乙酰丁香酮的對(duì)照組，②在根癌農(nóng)桿菌浸染液培育中加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，③在共培養(yǎng)階段加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，④在根癌農(nóng)桿菌浸染液和共培養(yǎng)基中都加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮可以提高轉(zhuǎn)化率，在菌液和共培養(yǎng)基中都加入乙酰丁香酮對(duì)提高轉(zhuǎn)化率效果最好（表３）。

研究共轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚３ ２００個(gè)，獲得抗性植株６２株，移栽后成活４２株（圖３），經(jīng)潮霉素篩選獲得的抗性苗移栽種植高達(dá)１ ｍ左右時(shí)，取其新葉提取ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ檢測，ＰＣＲ檢測結(jié)果表明４２株抗性苗中１６株為陽性植株，ＰＣＲ陽性植株率約為３８．１％。現(xiàn)有１６株陽性植株已經(jīng)結(jié)實(shí)，其Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等分子檢測有待進(jìn)行。

３討論

根癌農(nóng)桿菌作為自然界中存在的天然基因工程載體，具有操作方便、費(fèi)用低廉、可插入片段大的外源基因、不易發(fā)生重排、拷貝數(shù)低且符合孟德爾遺傳規(guī)律等優(yōu)點(diǎn)。但由于單子葉植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌不敏感，所以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要運(yùn)用于雙子葉植物。自１９９４年Ｈｉｅｉ利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法［８］、１９９６年Ｉｓｈｉｄａ［９］、以及１９９７年Ｃｈｅｎｇ［１０］對(duì)水稻、玉米和小麥的轉(zhuǎn)化成功后，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了大量的研究，并且取得了明顯的進(jìn)展［１１－１４］。

在轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)方面，除了胚性愈傷組織外，成熟胚、莖尖、子房及花粉等都有成功的報(bào)道。各種受體系統(tǒng)都具有各自的特點(diǎn)，如胚性愈傷組織數(shù)量多，而且處于分生細(xì)胞狀態(tài)，易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化率也較高。但再生植株嵌合現(xiàn)象嚴(yán)重。研究采用玉米成熟種子，使其處于萌發(fā)狀態(tài)以作受體，它具有實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡單、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不是很高、不依賴組織培養(yǎng)技術(shù)、能夠較快得到轉(zhuǎn)基因植株、并且不受季節(jié)的限制等優(yōu)點(diǎn)。其轉(zhuǎn)化原理可能是萌動(dòng)的種胚對(duì)外界因子的作用十分敏感，胚性細(xì)胞開始處于分裂狀態(tài)，子葉對(duì)胚芽的包裹不再嚴(yán)密。此時(shí)利用高活力的根癌農(nóng)桿菌浸染，將有利于對(duì)種胚生長點(diǎn)的轉(zhuǎn)化。加上對(duì)萌動(dòng)種胚的切割處理，為根癌農(nóng)桿菌進(jìn)入種子，與生長點(diǎn)細(xì)胞接觸提供了通道，有利于轉(zhuǎn)化的實(shí)現(xiàn)［６］。

利用種子萌動(dòng)胚為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法雖然有其優(yōu)點(diǎn)，但與其他受體系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法一樣，轉(zhuǎn)化率也受到根癌農(nóng)桿菌活化、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)條件等多種因素的影響。因此，今后需要開展更深入的研究，以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。

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