拮抗稻瘟病病菌放線菌Amy-627的篩選及鑒定

摘要：菌株Ａｍｙ－６２７是一株從長白山地區(qū)分離純化出的對２２種植物病原真菌和３種致病細(xì)菌都有較明顯抑制效果的放線菌，其抗菌譜較廣，尤其對水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）具有顯著的拮抗作用。通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化檢測及抑菌譜等一系列比較。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)該菌株與鏈霉菌屬的吸水鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）的特征基本相符，通過１６Ｓ ｒＤＮＡ序列比對同源性達(dá)９９％。根據(jù)多項分類原則和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建分析，將該菌株暫歸入吸水鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）類。

關(guān)鍵詞：水稻稻瘟病病菌；鏈霉菌；拮抗；篩選；鑒定

中圖分類號：Ｓ４７６文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2864-03

Screening and Identification of Amy-627 Strain against Pathogenic Fungus

Pyricularia oryzae

ＺＨＡＮＧ Ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇ，ＸＩＥ Ｃｈｅｎｇ－ｃｈｅｎｇ，ＧＯＮＧ Ｌｉ－ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｘｕｅ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｓｈａｎ １１４０４４，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｍｙ－６２７， ａｎ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｓｔｒａｉｎ， ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈａｎｇbａｉ mｏｕｎｔａｉｎ． Ｉｔ ｈａｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ２２ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ３ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ａｍｙ－６２７ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅ． Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ， ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ， Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ， ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｂｙ ｉｔ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ antimicrobial spectrum ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ comparatively． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗａｓ ９９％ by 16S rDNA sequences’ comparison． Base on ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ study and phylogenetic tree analysis， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ａｍｙ－６２７ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ for the time being．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ； ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

放線菌種類繁多，代謝功能各異，是一類有著廣泛實際用途的生物資源。在抗菌活性物質(zhì)的種類中，大約有７０％是由放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）產(chǎn)生的［１，２］。利用具有生命特征的生物體及其代謝分泌物、復(fù)制物（生物源）經(jīng)工藝加工而成的具有農(nóng)藥功能的有害生物控制劑——農(nóng)用抗生素類藥物，由于具有低毒、高效、選擇性強(qiáng)、殘留時間短、無公害等優(yōu)點，正日益受到世界各國的重視，并將成為今后農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展的主要方向之一。

水稻稻瘟病是一種世界性病害，在我國絕大多數(shù)水稻種植區(qū)域均有發(fā)生。流行年份一般可造成１０％～２０％的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重者可達(dá)５０％以上。稻瘟病在水稻整個生長階段皆可發(fā)生，具有危害時間長、侵染部位多和癥狀多樣性等特點，使化學(xué)防治難以達(dá)到預(yù)期的目的。近年來利用有益微生物來防治水稻稻瘟病已成為較流行的策略。放線菌廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境里，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的放線菌只占自然界存在的１０％～２０％，其資源利用還具有相當(dāng)大的空間。因此，對采自長白山地區(qū)不同類型土壤進(jìn)行了拮抗放線菌的篩選，并對抗菌效果最顯著的菌株進(jìn)行了鑒定，以期為抗菌活性物質(zhì)的提純提供試驗依據(jù)，也為進(jìn)一步的中試放大及大規(guī)模生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種５８株放線菌（分離自長白山地區(qū)不同類型土壤）及用于發(fā)酵液生物檢測的２２種植物病原真菌和３種致病細(xì)菌由遼寧科技大學(xué)生物工程實驗室生物制藥工藝室提供。

１．１．２培養(yǎng)基生物測定培養(yǎng)基：ＰＤＡ培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖９．０００ ｇ、玉米粉９．０００ ｇ、黃豆粉９．０００ ｇ、酵母膏１．２００ ｇ、牛肉膏０．３００ ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．２００ ｇ、ＮａＣｌ ０．６００ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１２０ ｇ、ＦｅＳＯ４ ０．００６ ｇ、ＺｎＳＯ４ ０．００３ ｇ、

ＭｇＳＯ４ ０．０６０ ｇ、去離子水３００ ｍＬ，ｐＨ值７．４～７．６。

１．１．３主要儀器光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、ＰＣＲ擴(kuò)增儀、核酸電泳儀、蛋白質(zhì)電泳儀、ＤＮＡ測序儀、高速離心機(jī)、恒溫?fù)u床。

１．２活性菌株的篩選及抗菌譜的測定

１．２．１菌株的培養(yǎng)將５８株放線菌接種于高氏一號培養(yǎng)平板內(nèi)（９ ｃｍ培養(yǎng)皿），２８ ℃培養(yǎng)７ ｄ后取１ ｃｍ直徑的菌碟待用。將２２株植物病原真菌和３株致病細(xì)菌分別接種于ＰＤＡ培養(yǎng)基和細(xì)菌培養(yǎng)基，真菌２５ ℃培養(yǎng)７２ ｈ，細(xì)菌３７ ℃培養(yǎng)４８ ｈ待用。

１．２．２菌株的篩選采用混菌法［３］對５８株放線菌進(jìn)行菌體抑菌活性的初篩。以水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）作為指示菌，２５℃培養(yǎng)７２ ｈ，篩選出抑菌活性明顯的菌株作為目的生防菌。

１．２．３抗菌譜的測定采用杯碟法對初篩得到的菌株進(jìn)行抗菌譜測定。牛津杯內(nèi)盛２００ μＬ發(fā)酵液，２５ ℃培養(yǎng)７２ ｈ（真菌）、３７ ℃培養(yǎng)４８ ｈ（細(xì)菌）后測定抑菌圈直徑。

１．３菌株鑒定

１．３．１形態(tài)特征采用插片法，２８ ℃培養(yǎng)７ ｄ，分別用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)。

１．３．２培養(yǎng)特征和生理生化檢測參照《鏈霉菌鑒定手冊》［４］推薦的部分培養(yǎng)基（表４）和方法進(jìn)行試驗，２８ ℃培養(yǎng)１６８ ｈ，觀察記錄特征［５］。

１．３．３１６Ｓ ｒＤＮＡ測序及序列分析用微波法［６］提取Ａｍｙ－６２７菌株總ＤＮＡ，進(jìn)行１６Ｓ ｒＤＮＡ的擴(kuò)增，根據(jù)１６Ｓ ｒＤＮＡ的結(jié)構(gòu)特點及其保守區(qū)設(shè)計特異引物（正向引物２７ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ

－３′；反向引物１５１０ｒ：５′－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴ

Ｔ－３′）。采用１％（m/v）瓊脂糖凝膠對ＰＣＲ產(chǎn)物電泳檢測［７］。將目的ＤＮＡ片段與其他ＤＮＡ盡可能分開，回收ＤＮＡ的瓊脂塊，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化好的菌體穿刺培養(yǎng)，由大連寶生物（工程）有限公司測序。將所得的序列與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對，并選取與試驗菌株序列相似度較高的菌株，用ＤＮＡｓｔａｒ軟件進(jìn)行序列排列分析，采用Ｂｏｏｔ－ｓｔｒａｐｉｎｇ法對所構(gòu)建的進(jìn)化樹［８，９］進(jìn)行評估，確定分離菌株的分類地位［１０］。

２結(jié)果與分析

２．１活性菌株的篩選和抗菌譜的測定

將５８株放線菌進(jìn)行抑菌活性的初篩，大多數(shù)菌株抑菌活性很小，但有８株放線菌對水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）有抑制作用，其中菌株Ａｍｙ－６２７的抑制效果最好（表１）。

對初篩得到的菌株Ａｍｙ－６２７進(jìn)行發(fā)酵液的抗菌譜測定，發(fā)現(xiàn)菌株Ａｍｙ－６２７的發(fā)酵液對２２種常見植物病原真菌有不同程度的抑制作用（表２、圖１），但對水稻紋枯病病菌、小麥赤霉病病菌卻沒有效果，并且發(fā)酵液對３種致病細(xì)菌也有一定的抑制作用（表３）。證明菌株Ａｍｙ－６２７所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的抑菌譜較廣，且對不同種類病原菌具有選擇性。

２．２拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的形態(tài)學(xué)觀察

通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株基內(nèi)菌絲不斷裂，無橫隔，成分枝狀；孢子渾圓至橢圓，表面光滑；孢子絲為松環(huán)、初級螺旋、鉤狀（圖２）。

２．３拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的培養(yǎng)特征和生理生化特征

表４為菌株Ａｍｙ－６２７在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果。按常規(guī)方法培養(yǎng)觀察，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株在馬鈴薯浸汁、伊莫松、無機(jī)鹽淀粉等６種培養(yǎng)基上生長良好，菌落為灰白色、不透明、表面成致密絲絨狀；氣生菌絲體為灰白色，基內(nèi)菌絲為白色，不產(chǎn)生可溶性色素。生理生化測定結(jié)果表明，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株革蘭氏染色陽性；明膠液化；牛奶凝固；不水解淀粉；能水解纖維素；硝酸鹽還原為陽性；不產(chǎn)生黑色素和Ｈ２Ｓ；能利用葡萄糖、果糖、木糖、肌醇、蔗糖、鼠李糖、甘露醇。

２．４拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的分子鑒定

通過ＰＣＲ方法克隆拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ，獲得１６Ｓ ｒＤＮＡ近全長序列，共１ ４７５ ｂｐ，電泳結(jié)果見圖３。ＢＬＡＳＴ相似性分析表明，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株與Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性為９９％，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖４。由此可見，拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株與Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ處于同一分支。

３結(jié)論和討論

當(dāng)氣溫在２０ ℃左右時，遇降雨，稻瘟病病菌便可產(chǎn)生大量分生孢子進(jìn)行侵染，逐步擴(kuò)展蔓延。在生產(chǎn)上常用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病害防治，但稻瘟病病菌會產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致化學(xué)防治的失敗。研究篩選的放線菌Ａｍｙ－６２７對稻瘟病病菌有較好的抑菌效果，有關(guān)菌株的生防效果和抑菌機(jī)理方面還有待進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，兩菌株１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同源性小于９７％時為不同的種，但同源性大于９７％時也不一定是同一個種。研究序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從其同源性高的菌株或系統(tǒng)發(fā)育樹上可看出，與拮抗放線菌Ａｍｙ－６２７菌株處于同一分支的是Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ，１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性為９９％，但在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性方面存在一些差異，故目前還不能將其完全歸為Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ。另外該菌株是否可被看作是農(nóng)用抗生素的一個新來源，還需要后續(xù)試驗的進(jìn)一步驗證。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文