百合多糖的含量測定及抗氧化活性研究

摘要：采用熱水浸提法從百合中提取百合多糖，蒽酮－硫酸法測定百合多糖的含量，對百合多糖的抗氧化活性進行了初步研究。結果表明，百合粗多糖中多糖含量達到了５２．９６％；在不同的抗氧化體系中百合多糖均有一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性與百合多糖的濃度呈一定的量效關系；對比維生素Ｃ試劑可知，在試驗濃度范圍內，百合多糖對Ｏ２－·和·ＯＨ的清除能力與維生素Ｃ相當，對ＮＯ２－的清除能力約為維生素Ｃ的１／５，還原能力約為維生素Ｃ的１／２５。

關鍵詞：百合多糖；含量測定；抗氧化活性

中圖分類號：Ｏ６５６．３４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2954-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ｌｉｌｙ ａｎｄ Iｔｓ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ

ＬＩ Ｌｉ－ｈｕａ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３００１，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Wａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ in ｌｉｌｙ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｈｒｏｎｅ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｌｉｌｙ ｒｅａｃｈｅｄ ５２．９６％． Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｓｓａｙｓ ｒｅｌａｔｅｄ to ｉｔｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ （Ｏ２－·） ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ（·ＯＨ） ｗａｓ ｅｑｕａｌ ｔｏ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ， ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｎｉｔｒｉｔｅ（ＮＯ２－） waｓ １／５ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ， ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １／２５ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： lｉｌｙ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ

百合又稱菜百合，為百合科百合屬中能形成鱗莖的栽培種群，多年生宿根草木植物。百合不僅是營養保健食品，而且具有良好的藥用價值，是衛生部審批通過的藥食兩用植物。現代分析表明，百合主要含秋水仙堿等多種生物堿和蛋白質、脂肪、淀粉、鈣、磷、鐵及維生素Ｂ１、維生素Ｂ２、維生素Ｃ、β－胡蘿卜素等營養物質，具有良好的滋補功效。中醫認為，百合味甘微苦，性平，入心，肺經，有潤肺止咳，清心安神之功，可用于熱病后余熱未清，虛煩驚悸，神志恍惚和肺癆久咳、咳血，肺膿瘍等［１］。

多糖是百合中的主要功能成分之一，具有抗腫瘤、免疫調節、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等生理功能，近年來已成為天然藥物研究的一個熱點［２］。目前，對百合多糖的研究多集中在多糖的提取工藝及多糖的分離純化［３，４］，對百合多糖含量的測定及抗氧化活性方面的文獻較少［５］。本研究采用熱水浸提法提取百合多糖，蒽酮－硫酸法測定多糖的含量，通過四個不同的抗氧化體系對百合多糖的抗氧化活性進行評價，并與合成抗氧化劑維生素Ｃ對照，將為研究百合多糖的藥理作用以及開發利用百合多糖提供一定的科學依據。

１材料與方法

１．１材料與試劑

百合：購于漢中國大藥房（經陜西理工學院生物學院植物學教研室鑒定）；取適量百合樣品，放入烘箱低溫烘干，粉碎過４０目篩備用。

鄰苯三酚，鄰菲羅啉，無水乙醇，亞硝酸鈉，雙氧水，硫酸亞鐵，三氯化鐵，三羥甲基氨基甲烷，２ ｇ／Ｌ蒽酮溶液（稱取０．２ ｇ蒽酮，加入質量分數為９８％的濃硫酸１００ ｍＬ，混合搖勻，置于棕色瓶中，冰箱保存）；葡萄糖，鐵氰化鉀，三氯乙酸，檸檬酸，對氨基苯磺酸，鹽酸萘己二胺等均為國產分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

１．２儀器

ＧＲ－２００電子分析天平（日本Ａ＆Ｄ公司）；１０１型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；７２２Ｎ型可見分光度計（上海精密科學儀器有限公司）；ＴＤＬ－５臺式離心機（上海安亭科學儀器制造廠）； ＳＨＺ－Ｄ（ＩＩＩ）循環水式真空泵（鞏義市豫華儀器有限責任公司）。

１．３方法

１．３．１粗百合多糖的提取取一定量預處理的百合樣品，按料液質量比１∶１０加入９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇常溫下浸泡１２ ｈ，過濾。濾渣按料液質量比１∶３０加蒸餾水［６］，８０℃水浴保溫２ ｈ，減壓抽濾，濾渣重復浸提得二次濾液，合并濾液，濃縮，加入３倍濃縮液體積的９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇，置４ ℃冰箱中過夜，待絮狀凝膠物和粒狀沉淀析出后，以３ ０００ ｒ/min離心２０ ｍｉｎ，棄上清，沉淀經復溶、離心、過濾后，依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，冷凍干燥得百合多糖粗提物，待用。

１．３．２粗百合多糖的含量測定多糖的測定方法［７］有蒽酮－硫酸法、高效液相色譜法、苯酚－硫酸法、酶法等。本文采用蒽酮－硫酸法，測定原理是多糖類化合物在濃硫酸的作用下水解為單糖，并迅速生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再與蒽酮結合成有色化合物，在一定范圍內，其顏色深淺與多糖的含量成線性關系，可用比色法在一定波長下測定多糖的含量。稱取蒽酮５０ ｍｇ，置于錐形瓶中，加蒸餾水２５ ｍＬ溶解，然后加入硫酸７５ ｍＬ，即得，現配現用。

１．３．３標準曲線的繪制精密稱取１０５ ℃下干燥恒重的分析純葡萄糖０．０１０ ２ ｇ，以水溶解后定容于１００ ｍＬ容量瓶中，配制濃度為０．１０２ ｍｇ／ｍＬ葡萄糖標準溶液。分別準確移取葡萄糖標準溶液０．１、０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ于１０ ｍＬ比色管中，加水補足至１.0 ｍＬ。在冰水浴中迅速加入２ ｇ／Ｌ蒽酮溶液４ ｍＬ，搖勻，在沸水浴中加熱８ ｍｉｎ，取出，自來水冷卻至室溫后在１０ ｍｉｎ內于波長５８５ ｎｍ下測定吸光度，以蒸餾水代替樣液作空白，以葡萄糖含量為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線并計算回歸方程和相關系數。

１．３．４百合多糖的含量測定分別精密稱?。埃保?ｇ百合多糖粗提物３份，用蒸餾水溶解后定容至１００ ｍＬ，準確吸?。埃?ｍＬ稀釋液于１０ ｍＬ比色管中，后續步驟同１．３．３“加水補足至１.0 ｍＬ”。比色后，通過回歸方程計算得到粗提物溶液中多糖濃度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）以及百合多糖在粗提物中的百分含量和ＲＳＤ值。

１．３．５百合多糖對超氧自由基（Ｏ２－·）的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法［８］。在堿性條件下，鄰苯三酚迅速發生自氧化，生成紅色中間產物，同時釋放出Ｏ２－·，Ｏ２－·可加速鄰苯三酚自氧化速率。當有清除劑存在時，可清除Ｏ２－·，從而阻止中間產物的積累，通過比色法檢驗物質清除Ｏ２－·的能力。測定步驟為：?。埃埃?ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值為８．２的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液６ ｍＬ，加入盛有２．２ ｍＬ蒸餾水的試管中，置２５ ℃水浴中預熱２０ ｍｉｎ，分別精確吸取不同濃度的粗百合多糖液０．５ ｍＬ，立即加入在２５ ℃水浴中預熱的７ ｍｍｏｌ／Ｌ鄰苯三酚（由１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ配制）１ ｍＬ，立即混勻，在２５ ℃水浴中準確反應４ ｍｉｎ后，加入８ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液０．１ ｍＬ終止反應，并測定３２０ ｎｍ處的吸光值。配制同濃度的維生素C溶液做陽性對照，按下式計算清除率：Ｏ２－·清除率＝（Ａ空白－Ａ樣品）／Ａ空白×１００％。

１．３．６百合多糖對羥基自由基（·ＯＨ）的清除作用參照Ｆｅｎｔｏｎ反應法建立·ＯＨ自由基體系模型［９］。Ｈ２Ｏ２與Ｆｅ２＋混合后產生·ＯＨ的Ｆｅｎｔｏｎ反應為：Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２＋＝ＯＨ－＋·ＯＨ＋Ｆｅ３＋，·ＯＨ反應活性高，存在時間短，若體系中加入鄰二氮菲，能有效捕捉·ＯＨ并產生有色產物，產物在５３６ ｎｍ處有強吸收，加入清除劑后，便會與鄰二氮菲競爭結合·ＯＨ，從而使有色產物的生成量減少，降低溶液在５３６ ｎｍ處的吸光度值。因此可通過測定添加試樣前后吸光度來判定試樣的清除效果。測定步驟為：依次加入鄰二氮菲１．５ ｍＬ，ｐＨ值為 ７．４的磷酸鹽－生理鹽水緩沖液３．８ ｍＬ及不同濃度的粗百合多糖液０．５ ｍＬ（損傷管及未損傷管不加多糖溶液）混勻，再加硫酸亞鐵溶液１．５ ｍＬ，立即混勻，最后加雙氧水１ ｍＬ（未損傷管不加）。最終濃度鄰二氮菲０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸亞鐵溶液０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ、雙氧水０．０１％（Ｖ／Ｖ），總體積９ ｍＬ（不足用蒸餾水補足）。把各管置于３７ ℃恒溫水浴箱保溫６０ ｍｉｎ，分別測定各管Ａ５３６ｎｍ值。配制同濃度維生素C溶液做陽性對照，按下式計算清除率：·ＯＨ清除率＝（Ａ樣品－Ａ損傷）/（Ａ未損－Ａ損傷）×１００％。

１．３．７百合多糖對亞硝酸鹽（ＮＯ２－）的清除作用亞硝酸鈉在弱酸性條件下，與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合，生成的紅色化合物在５４４ ｎｍ處有特征吸收峰，加入清除劑后，可有效清除ＮＯ２－，使亞硝酸鈉含量減少，從而使紅色化合物生成減少，吸光度值下降，可通過添加試樣前后吸光度值的變化判定試樣對ＮＯ２－的清除效果［１０，１１］。測定步驟為：分別精確吸取不同濃度的粗百合多糖液３ ｍＬ于２５ ｍＬ容量瓶，加入５ μｇ／ｍＬ的亞硝酸鈉標準液３ ｍＬ，檸檬酸－磷酸緩沖液（ｐＨ值３．０）５ ｍＬ，３７ ℃水浴中反應１５ ｍｉｎ后，立即加入２ ｍＬ ４ ｇ／Ｌ對氨基苯磺酸溶液混勻，靜置３～５ ｍｉｎ，加入２ ｇ／Ｌ鹽酸萘己二胺溶液１ ｍＬ，用蒸餾水定容至２５ ｍＬ，靜置１５ ｍｉｎ后，測定５４４ ｎｍ處吸光值。配制不同濃度的維生素C溶液做陽性對照，按下式計算清除率：

ＮＯ２－清除率＝（Ａ未加提取液－Ａ加提取液）／Ａ未加提取液×１００％。

１．３．８百合多糖還原能力的測定采用普魯士蘭法［１２］。其原理是試樣將赤血鹽［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］還原成黃血鹽［Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６］，黃血鹽再與Ｆｅ３＋作用，生成普魯士藍，在７００ ｎｍ波長測定吸光值，以檢測普魯士藍的生成量來衡量試樣的還原能力，吸光值愈高，表示試樣的還原能力愈強。測定步驟為：分別精確吸取不同濃度的粗百合多糖液２ ｍＬ，加入ｐＨ值為６．６的磷酸鹽緩沖液２．５ ｍＬ和１０ ｇ／Ｌ的鐵氰化鉀溶液２．５ ｍＬ，搖勻并定容至１０ ｍＬ，在５０ ℃保溫２０ ｍｉｎ，急速冷卻，加入１０％（Ｖ／Ｖ）的三氯乙酸２．５ ｍＬ，混勻后以３ ０００ ｒ/min離心１０ ｍｉｎ，取上清液２．５ ｍＬ，加蒸餾水２．５ ｍＬ和１ ｇ／Ｌ的三氯化鐵溶液０．５ ｍＬ，室溫放置１０ ｍｉｎ后，測定７００ ｎｍ處的吸光值，吸光值越大，表明還原能力越強。配制不同濃度的維生素C溶液做為對照。

2結果與分析

2．１標準曲線的測定和回歸方程的建立

由圖１的標準曲線得到回歸方程為：Ａ＝９．９６９ ９Ｘ＋０．００６ ９，r＝０．９９９ ３。

2．３．２百合多糖對·ＯＨ的清除作用

按照１．３．６的方法，得到多糖溶液、對照品維生素Ｃ對羥基自由基（·ＯＨ）的清除作用如圖３所示。由圖３可知，不同濃度的多糖溶液和維生素Ｃ都具有一定的清除·ＯＨ的能力，并呈一定的量效關系；在試液濃度為１．０ ｍｇ／ｍＬ時，多糖對·ＯＨ的清除能力最強，清除率幾乎達到６５％，相同濃度維生素C的清除率為７２．７％，由此可看出百合多糖對·ＯＨ表現出較強的清除作用，與維生素C試劑相當。

2．３．３百合多糖對ＮＯ２－的清除作用按照１．３．７的方法得到多糖溶液、對照品維生素Ｃ對ＮＯ２－的清除作用如圖４、圖５所示。由圖４、圖５可得，不同濃度的多糖溶液和維生素Ｃ對ＮＯ２－都有清除作用，清除率均隨著濃度的增加而增強；在試驗濃度范圍內，多糖濃度為１．０ ｍｇ／ｍＬ時對ＮＯ２－的清除率達到最大，為５５．１％，對照品維生素Ｃ在試驗濃度范圍內的最大清除率為５９．１％，相應濃度為０．２０ ｍｇ／ｍＬ，由清除率可看出多糖與維生素Ｃ清除率相當，對比濃度可知，多糖濃度均為相應維生素Ｃ濃度的近５倍，由此表明，百合多糖對ＮＯ２－的清除能力不及維生素Ｃ，約為維生素Ｃ試劑的１／５。

2．３．４百合多糖的還原能力按照1.3.8的方法得到多糖溶液、對照品維生素Ｃ還原能力的變化趨勢如圖６、７所示。由圖６、７可知，多糖、維生素Ｃ的還原能力均與各自的濃度呈正相關，多糖和維生素Ｃ在試驗濃度范圍內的最大吸光度值分別為０．４２５、０．４８９，而多糖濃度約為相應維生素Ｃ濃度的２５倍，說明百合多糖的還原能力低于維生素Ｃ，約為維生素C試劑的１／２５。

3結論

１）采用９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇對百合提前浸泡，以除去單糖、低聚糖等干擾成分，再用蒸餾水８０ ℃浸提百合中的活性多糖，蒽酮－硫酸比色法測定粗多糖中多糖的含量，結果表明百合粗提物中的多糖平均含量為５２．９６％，ＲＳＤ值為０．９６％。

２）抗氧化活性試驗結果表明，百合多糖在不同的抗氧化體系中均表現出一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性隨著濃度的增加而增強；對比維生素Ｃ試劑可知，在試驗濃度范圍內，百合多糖對Ｏ２－·的清除能力與維生素C試劑接近，但稍低于維生素Ｃ，對·ＯＨ的清除作用與維生素Ｃ試劑相當，對ＮＯ２－的清除能力不及維生素Ｃ，約為維生素Ｃ試劑的１／５，百合多糖的還原能力低于維生素Ｃ，約為維生素Ｃ試劑的１／２５。

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