大孔吸附樹脂對竹葉蘭中總黃酮的分離純化

摘要：大孔吸附樹脂分離純化竹葉蘭總黃酮的最佳工藝條件為上樣液濃度２．５0 ｇ／Ｌ，上樣速率３.0 ＢＶ／ｈ，洗脫劑８０％乙醇，洗脫速率３.0 ＢＶ／ｈ，洗脫劑用量４.0 ＢＶ，按此工藝條件純化后的竹葉蘭總黃酮純度達８１．５８％。ＡＢ－８型大孔吸附樹脂對竹葉蘭總黃酮有較好的吸附和解吸效果。

關鍵詞：大孔吸附樹脂；總黃酮；分離純化；竹葉蘭

中圖分類號：Ｓ５６７．２；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2939-04

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｂｙ ＡＢ－８ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ

ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆｅｎ，ＺＨＯＵ Ｘｕｅ－ｊｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｇｏｎｇ－ｘｉｎ，ＦＵ Ｙａｎ－ｌｉ，ＧＡＯ Ｙｕｎ－ｔａｏ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００３１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｂｙ ＡＢ－８ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｌｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ were as follows ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗas ２．５0 ｇ／Ｌ ａｎｄ ３.0 ＢＶ／ｈ respectively； tｈｅ ｅｌｕａｎｔ wａｓ ８０％ ｅｔｈａｎｏｌ； ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｎｇ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｗａｓ ３.0 ＢＶ／ｈ， and tｈｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｕａｎｔ wａｓ ４ＢＶ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Tｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ reached up to ８１．５８％ under these conditions. Tｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｄｓｏｒｂｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ ｉｎ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｗａｓ １６．９４ ｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＡＢ－８ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ waｓ ｆｉｔ ｆｏｒ ａｄｓｏｒｂｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎｓ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ

竹葉蘭（Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ）為蘭科竹葉蘭屬植物，又名黃竹參［１］，傣藥名為紋尚海［２］，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，是一種重要的傣族解藥，其藥用部位主要為根莖，具有清熱解毒、祛風除濕、散瘀止痛、消炎、利尿等作用［３－５］。

黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物。到目前為止，已經發現有５ ０００多種植物中含有黃酮類化合物［６］。對植物黃酮類化合物進行純化以獲得高純度黃酮具有重要意義［７］。

大孔樹脂分離技術是２０世紀６０年代末發展起來的繼離子交換樹脂后的分離新技術之一。大孔吸附樹脂的孔徑與比表面積都比較大，在樹脂內部具有三維空間立體孔結構，由于具有物理化學穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長等諸多優點［８］，廣泛應用于中草藥化學成分的提取、分離、富集和中藥復方制劑去除雜質等方面［９］。

近年來報道了許多大孔樹脂在黃酮、皂甙等天然活性物質的分離純化方面的研究［１０，１１］。通過對大孔吸附樹脂法純化竹葉蘭中總黃酮工藝進行探討，以期得到高純度竹葉蘭總黃酮，為竹葉蘭總黃酮類產品的開發和研究提供參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１竹葉蘭竹葉蘭（干品，購于西雙版納傣醫醫院），用前粉碎至８０目以下。

１．１．２試劑ＡＢ－８型大孔吸附樹脂（南開大學化工廠），使用前按說明進行預處理；蘆丁標準品購于Sｉｇｍａ公司，乙醇，石油醚，甲醇，５％ＮａＮＯ２溶液，１０％ Ａ１（ＮＯ３）３溶液，４％ＮａＯＨ溶液，所用試劑均為分析純。

１．１．３儀器７２００型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；ＡＳ３１２０Ａ超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；層析柱；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠） ；ＴＨ２－８２Ｂ氣浴恒溫振蕩器；ＡＬ２０４電子天平。

１．２方法

１．２．１竹葉蘭粗提取液的制備［１２］準確稱取竹葉蘭粉末１．００ ｇ于１００ ｍＬ具塞錐形瓶中，加入１０ ｍＬ ６０％乙醇溶液，超聲提取３０ ｍｉｎ后，抽濾。濾渣再用７０％的乙醇超聲浸提３０ ｍｉｎ，共浸提３次。過濾后合并３次濾液，于旋轉蒸發儀濃縮至干。稱重，備用。用７０％乙醇溶液定容至２５ ｍＬ作為待測液。

１．２．２總黃酮含量的測定

１）對照品溶液的制備。精確稱取１０５ °Ｃ干燥至恒重的蘆丁對照品２０ ｍｇ，置于1００ ｍＬ容量瓶中，加８０％乙醇溶解至刻度，搖勻得濃度為０．２ ｍｇ／ｍＬ的對照品溶液，備用。

２）標準曲線的制作［１3］。分別吸取０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０ ｍＬ對照品溶液，分別置于２５ ｍＬ比色管中，各加３０％乙醇定容至１０ ｍＬ，加５％ＮａＮＯ２溶液１ ｍＬ，搖勻放置６ ｍｉｎ，再加１０％

Ａｌ（ＮＯ３）３溶液１ ｍＬ，搖勻，再放置６ ｍｉｎ，加４％ＮａＯＨ溶液１０ ｍＬ，用去離子水定容至刻度，搖勻放置１５ ｍｉｎ，以去離子水作參比，用１ ｃｍ的比色皿于波長５１０ ｎｍ處測定其吸光度，以吸光度Ａ為縱坐標，以蘆丁標準溶液的濃度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）為橫坐標繪制標準曲線，用最小二乘法進行回歸，得到吸光度和蘆丁標準溶液濃度的回歸方程：Ａ＝１２．５４６ ０Ｃ＋０．００５ ８，ｒ＝０．９９９ ８。該方法在０．００８～０．０６４ ｍｇ／ｍＬ濃度范圍內呈良好的線性關系。

３）總黃酮含量的測定。采用ＮａＮＯ３－Ａ１（ＮＯ３）３比色法，按照標準曲線制作的方法對竹葉蘭樣品溶液中總黃酮含量進行測定，得到不同條件下的吸光度值，利用蘆丁標準曲線方程進行計算，從而得到測定液中的總黃酮含量。

１．２．３ＡＢ－８樹脂的預處理［１4］大孔樹脂用９５％乙醇浸泡２４ ｈ，充分溶脹后，用乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗盡乙醇；用５％ＨＣｌ溶液浸泡８ ｈ，再用去離子水洗至ｐＨ值為７，接著用５％ ＮａＯＨ溶液浸泡８ ｈ，再用去離子水洗至ｐＨ值為７，浸泡于去離子水中備用。

１．２．４靜態吸附-解吸試驗

１）靜態吸附量的測定。取ＡＢ－８大孔樹脂１０ ｍＬ，置于１００ ｍＬ的具塞磨口三角瓶中，精密加入供試液１００ ｍＬ，密封后在振蕩培養箱中恒溫（２５ ℃） 振蕩吸附。分別在振蕩吸附０、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、１０．０、１２．０、２４．０ ｈ時取２ ｍＬ上清液測定總黃酮含量， 按下式計算樹脂對總黃酮的吸附量（ｇ／L）

Ｑｅ＝Ｖ０（C０－Cｅ）／Ｇ

式中，Ｑｅ為飽和吸附量（ｇ／Ｌ）；C０為初始濃度（ｇ／Ｌ）；Cｅ為吸附后濃度（ｇ／Ｌ）；Ｖ０為樣品溶液體積（Ｌ）；Ｇ為樹脂量（ｍＬ）。

１．２．５動態吸附-解吸試驗

１）吸附率、解吸率的測定。１０ ｍＬ大孔樹脂濕法裝柱，粗提液以一定流速上樣，待樹脂吸附飽和后，再以一定體積分數的乙醇溶液進行洗脫，根據以下公式計算吸附率和解吸率。

Ｅ＝（C０－Cｅ）Ｖ０／C０Ｖ０

Ｄ＝CｄＶｄ／（C０－Cｅ）Ｖ０

式中，Ｅ為吸附率；Ｄ為解吸率；C０為初始濃度（ｇ／Ｌ）；Cｅ為吸附后濃度（ｇ／Ｌ）；Cｄ為洗脫液濃度（ｇ／Ｌ）；Ｖ０為樣品溶液體積（Ｌ）；Ｖｄ為洗脫液總體積（ｍＬ）。

２）樹脂吸附泄漏曲線的測定。１０ ｍＬ大孔樹脂濕法裝柱，粗提液以一定流速上樣，每１０ ｍＬ為１份收集濾液，檢測收集液總黃酮含量，繪制泄漏曲線。

３）動態洗脫曲線的測定。飽和吸附的樹脂，用去離子水洗脫３．０ＢＶ，再用８０％乙醇溶液以３．０ ＢＶ／ｈ的流速洗脫，每１０ ｍＬ為１份收集洗脫液，檢測洗脫液總黃酮含量，繪制洗脫曲線。

２結果與分析

２．１ＡＢ－８大孔吸附樹脂對竹葉蘭總黃酮的靜態吸附-解吸結果

２．１．１靜態吸附動力學曲線測定不同時間ＡＢ－８大孔樹脂的吸附量，繪制樹脂的靜態吸附動力學曲線，如圖１所示。由圖１可知，隨著振蕩吸附時間的增加，樹脂對總黃酮的吸附量不斷增加。當吸附時間到達１０.0 ｈ時，樹脂吸附量慢慢達到飽和，吸附量的上升趨勢變緩，逐漸趨于不變。因此提高吸附時間有利于提高樹脂的使用效率。但考慮到吸附時間過長會導致試驗時間過長，影響試驗進度。因此吸附時間控制在１０.0 ｈ左右。

２．１．２粗提液總黃酮濃度對樹脂吸附效果的影響配制濃度分別為１．００、１．５０、２．０0、２．５０、３．００、３．５０、4.00 ｇ／Ｌ的粗提液，進行ＡＢ－８大孔樹脂靜態吸附試驗（吸附時間２４.0 ｈ），結果如圖２所示。由圖２可知，在樣品濃度較低的條件下，隨著溶液初始濃度的提高，總黃酮的吸附量迅速增加，當樣品濃度達到２．５０ ｇ／Ｌ左右時，吸附量上升的趨勢變緩。因此，提高上樣液濃度有利于提高樹脂的使用效率。但是考慮到樣品濃度過高，上樣液可能出現絮凝和沉淀，從而造成樹脂被堵塞和污染，影響了其吸附能力。因此，上樣液濃度控制在２．５０ ｇ／Ｌ。

２．１．３洗脫溶劑體積分數對解吸效果的影響取１０ ｍＬ飽和吸附的ＡＢ－８大孔樹脂于錐形瓶中，加入１００ ｍＬ不同體積分數的乙醇溶液，進行ＡＢ－８大孔樹脂靜態解吸試驗（解吸時間４.0 ｈ），結果見圖３。竹葉蘭總黃酮一般應用在食品及醫藥領域，因此選用乙醇作為解吸劑，考察乙醇體積分數對解吸率的影響。如圖３所示，隨著乙醇體積分數增加，解吸率呈先升高后下降的趨勢，當乙醇體積分數為８０％時，解吸率達到８９．４３％。因此，選用８０％乙醇溶液對竹葉蘭總黃酮的動態解吸進行研究。

２．２ＡＢ－８大孔吸附樹脂對竹葉蘭總黃酮的動態吸附-解吸結果

２．２．１上樣速率對吸附率的影響大孔樹脂濕法裝柱，粗提液分別以１.0、２.0、３.0、４.0、５.0 ＢＶ／ｈ的流速上樣，收集濾液，測流出液總黃酮濃度，計算吸附率，結果如圖４所示。由圖４可以看出，ＡＢ－８大孔樹脂的吸附率隨著流速的增加而有所降低，當上柱流速為１．０ＢＶ／ｈ時，樹脂的吸附率為８５．６６％；當流速提高到５．０ＢＶ／ｈ時，其動態吸附率降至６５．５％。這是因為隨著上樣流速增大，料液中大多黃酮類化合物還未來得及擴散到樹脂內部，就被沖出柱子，導致樹脂的總黃酮吸附量有所降低。雖然較低的流速對吸附有利，但流速過低，操作時間長，在實際生產中選擇上柱速率應綜合考慮吸附量與效率，以３．０ ＢＶ／ｈ左右的流速進行上柱為宜。

２．２．４洗脫體積對解吸率的影響控制洗脫乙醇體積分數為８０％，解吸速率為３．０ ＢＶ／ｈ，考察不同洗脫體積下的解吸率，結果如圖７所示。由圖７可以看出，洗脫體積對洗脫效果有明顯的影響。當洗脫量為１．０ ＢＶ時，解吸率只有３９．８８％；而洗脫量達4．０ ＢＶ時，解吸率升至 ８９．５６％。當洗脫量繼續增加，解吸率變化甚微。因此，從節約成本角度出發，洗脫劑用量宜控制在４．０ ＢＶ左右。

２．２．５動態洗脫曲線的繪制對飽和吸附的ＡＢ－８大孔樹脂，根據靜態解吸所確定的最佳洗脫體積分數為８０％乙醇溶液，動態吸附所確定的最佳洗脫速率為３．０ ＢＶ／ｈ，每５ ｍＬ為１份收集濾液，檢測收集液總黃酮含量，得到室溫下乙醇溶液對ＡＢ－８樹脂吸附的竹葉蘭總黃酮的動態洗脫效果，洗脫曲線如圖８所示。由圖８可知，總黃酮容易洗脫，洗脫高峰相對集中，１．５～３．０ ＢＶ洗脫液中的總黃酮含量較高。合并總黃酮含量較高的洗脫液，冷凍干燥，純化后的竹葉蘭總黃酮純度達８１．５８％（ｎ＝３）。

３結論

當竹葉蘭總黃酮粗提液總黃酮濃度為２．５0 ｇ／Ｌ，上樣速率為３．０ ＢＶ／ｈ時，ＡＢ－８型大孔樹脂對竹葉蘭總黃酮的吸附量較大。

通過靜態、動態吸附-解吸試驗比較，發現ＡＢ－８型大孔吸附樹脂有良好的吸附性能和解吸效果，得出竹葉蘭總黃酮的最佳吸附條件為：上柱料液濃度２．５0 ｇ／Ｌ，控制上柱速率為３．０ ＢＶ／ｈ。最適解吸條件為：洗脫液乙醇體積分數為８０％，解吸速率３．０ ＢＶ／ｈ，洗脫體積為４．０ ＢＶ。

ＡＢ－８型大孔吸附樹脂對竹葉蘭總黃酮具有良好富集作用，對分離純化竹葉蘭總黃酮具有可行性。

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