不溶性草酸氧化酶的部分純化研究

摘要：以大麥麥麩為原料，對不溶性草酸氧化酶進行了部分純化，比較了酶法與滴定法測定草酸的方法。結果表明，粗酶經酸熱變性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗滌、去離子水洗滌４個步驟的純化后，不溶性草酸氧化酶的純化倍數為１．５１；酶法與滴定法測定草酸無顯著性差異。該技術有望用于草酸檢測試劑盒的開發。

關鍵詞：麥麩；不溶性草酸氧化酶；部分純化

中圖分類號：Ｑ８１４．９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2943-02

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｏｘａｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ

ＺＨＡＮＧ Ｍｅｎｇ－ｃｈｅｎｇ，ＸＵ Ｃｈｕｎ－ｈｕｉ，ＨＵ Ｙｉ－ｈｏｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｏｕｄｉ ４１７０００， Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ was explored. And ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ for ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ was compared． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ １．５１－ｆｏｌｄ after ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｍｙｌａｓｅ， ｗａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ＮａＣｌ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ； ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ； ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

草酸檢測廣泛應用于食品、養殖等行業對原料的質量鑒定，常采用色譜法、滴定法和酶法。其中酶法檢測最為快捷，成本低，應用前景廣闊［１，2］。酶法檢測通常采用草酸氧化酶（Ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＯｘＯ）與ＰＯＤ偶聯，檢測草酸氧化產生的Ｈ２Ｏ２的量以確定草酸含量。該試驗采用市售大麥麩皮為原料，對不溶性ＯｘＯ進行部分純化，旨在建立低成本制備ＯｘＯ的方法，達到廉價、快速測定草酸的目的。

１材料與方法

１．１材料

市售大麥麩皮；小麥品種煙優３６１，青島農業大學提供；４－氨基氨替吡啉，Ｓｉｇｍａ公司；其他試劑均為國產分析純。

１．２方法

１．２．１不溶性ＯｘＯ的部分純化磨碎大麥麩皮，經２００目過篩，稱取過篩物５０ ｇ，加入等體積的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值為３．８的琥珀酸溶液，７０ ℃水浴１５ ｍｉｎ。5 000 g離心５ ｍｉｎ，去除析出的黏稠物，５０ ℃烘干，加入等體積０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值為６．８的磷酸緩沖液、２ ｇ淀粉酶，３７ ℃保溫１ ｈ，離心收集沉淀；加入等體積的１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液３０ ℃保溫１ ｈ，同樣方法離心收集沉淀。去離子水淋洗３次，離心收集沉淀，５０ ℃烘干沉淀，研磨后經２００目過篩，過篩物即為部分純化的不溶性ＯｘＯ，置于干燥皿中備用。

1.2.2測定方法

1）ＯｘＯ活性測定。參照劉娥娥等［３］的方法，１ ｍＬ反應體系中含４－氨基氨替吡啉０．４ ｍｇ，５ Ｕ ＰＯＤ，６ ｍｇ琥珀酸，０．２５ μＬ Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺，７５％乙醇，用ＮａＯＨ調整ｐＨ值至３．８，加入５０ ｍｇ不溶性ＯｘＯ，以０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的草酸啟動反應，不加草酸的反應體系為空白，測定３０ ｍｉｎ后的ＯＤ５５５。以室溫下每分鐘產生１ μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２為１ Ｕ。

2）Ｈ２Ｏ２生成檢測。采用顯色液檢測ＯｘＯ在無草酸條件下是否有紅色物質生成。

3）ＰＯＤ、ＣＡＴ活性測定。采用張龍翔等［４］的方法測定。

4）不溶性糖測定。參照胡居吾等［５］的方法，用２ ｍＬ １０％的硫酸溶解０．１ ｇ不溶性ＯｘＯ，去離子水定容至５００ ｍＬ，取１ ｍＬ置于試管中，加入１ ｍＬ ２％的苯酚、５ ｍＬ濃硫酸，３０ ｍｉｎ后檢測ＯＤ４９０。標準曲線采用葡萄糖制備。

5）草酸測定。酶法測定草酸，采用Ｌｉｕ等［２］的方法。滴定法測定草酸，采用Ｂａｋｅｒ［６］的方法。

２結果與分析

２．１不溶性ＯｘＯ的部分純化

經２００目過篩的粗酶經酸熱變性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗滌、去離子水洗滌４個步驟的純化結果見表１。不溶性ＯｘＯ是一類耐高溫的多聚糖蛋白，分析不溶性總糖含量，最終純化倍數為１．５１。

３討論

ＯｘＯ是快速檢測草酸的工具酶，有學者曾嘗試用可溶性ＯｘＯ與不溶性ＯｘＯ共同參與反應，或直接用不溶性ＯｘＯ測定草酸含量，說明不溶性ＯｘＯ能作為酶法測定草酸的工具酶。同時，以不溶性ＯｘＯ作為工具酶參與反應，更加接近ＯｘＯ在自然生理條件下的狀況，可靠性更高。

大麥麥麩中的不溶性ＯｘＯ活性高，是熱穩定的糖蛋白，適合作為不溶性ＯｘＯ大量制備的廉價原料。經過酸熱變性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗滌等步驟的純化，純化倍數達到1.51，排除了麥麩中對Ｈ２Ｏ２顯色的干擾物質，適合作為草酸測定的工具酶使用。我們采用從大麥麥麩中提取不溶性的ＯｘＯ，克服了上述缺點。這一方法有望為研制有自主產權的草酸測定試劑盒提供技術參考。

參考文獻：

［１］ 胡一鴻，李向陽，莫億偉． 植物草酸氧化酶［Ｊ］． 生命的化學，２００９，２９（２）：２９５－２９７．

［２］ ＬＩＵ Ｅ Ｅ， ＬＯＵ Ｗ， ＺＨＯＵ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００９，５３（１）：１２９－１３２．

［３］ 劉娥娥，郭振飛． 小麥萌發素Ｇ和ψＧ的純化及其部分特性［Ｊ］． 植物生理與分子生物學學報，２００４，３０（４）：３９３－３９８．

［４］ 張龍翔，張庭芳，李令媛． 生物化學實驗技術［Ｍ］． 第二版. 北京：高等教育出版社，２００２．

［５］ 胡居吾，范青生，肖小年． 粗多糖測定方法的研究［Ｊ］． 江西食品工業，２００５ （１）：１６－１８．

［６］ ＢＡＫＥＲ Ｃ Ｊ Ｌ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｓｔ， １９５２， ７７：３４０－３４４．

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