HPV 16,HPV 18,HSV-2多重感染與宮頸癌的相關性研究

[摘要] 目的 探討HPV16、HPV18、HSV-2多重感染在宮頸癌發病及其進展中的作用。方法 選擇120例宮頸癌標本及60例正常宮頸組織標本分別作為宮頸癌組及對照組，采用RT-PCR技術進行HPV16、HPV18、HSV-2檢測，比較兩組HPV16、HPV18、HSV-2感染情況，并分析宮頸癌HPV16、HPV18、HSV-2感染與腫瘤分化程度及腫瘤分期的關系。結果 宮頸癌組HPV16、HPV18、HSV-2單獨感染及混合感染構成比高于對照組。HPV16、HPV18、HSV-2多重感染與宮頸癌FIGO分期及分化程度呈現相關關系。結論 HPV16、HPV18、HSV-2多重感染同宮頸癌發病具有相關性，可能是宮頸癌發病及進展的高危因素。

[關鍵詞] 宮頸癌；HPV16，HPV 18，HSV-2；多重感染；腫瘤分期；腫瘤分化

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）26-08-02

Study on Correlation between HPV16，HPV18，HSV-2 Multiple Infection and Cervical Cancer

LIU Haiqing

Zhoushan City Maternal and Child Health Hospital，Zhoushan 316000，China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Human papilloma virus （HPV）16，HPV18， herpes simplex virus（HSV）-2 multiple infection in cervical cancer. Methods All 120 tissue samples of uterine cervix cancer and 60 tissue Samples of cervix uteri in normal women were selected as uterine cervix cancer group and control group. Expressive rate of HPV16， HPV18 and HSV-2 were detected with RT-PCR，infaction rate of HPV16， HPV18 and HSV-2 were compared between uterine cervix cancer group and control groups. Correlation of HPV16，HPV18，HSV-2 infection with stage and differentiation of cervical cancer were analyzed. Results Solitary and multiple infection rate of HPV16， HPV18 and HSV-2 was higher in uterine cervix cancer group than in control group，correlation test shown that multiple infection HPV16， HPV18， HSV-2 was correlative with FIGO stage and differentiation of uterine cervix cancer. Conclusion Multiple infection HPV16， HPV18， HSV-2 was correlative with uterine cervix cancer， that maybe was high risk factor of genesis and progression in uterine cervix cancer.

[Key words] Cervical cancer； HPV16，HPV18；HSV-2；Tumor stage；Differentiation

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居女性惡性腫瘤的第2位，近年來的研究結果顯示[1]，宮頸癌的發病率呈現上升趨勢，發病年齡年輕化，病死率不斷上升[1]，仍是女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一。病毒感染是宮頸癌發病高度相關的因素之一，HPV16、HPV18、HSV-2均是宮頸組織容易感染的病毒，本文就HPV16、HPV18及HSV-2多重感染與宮頸癌的發病及其進展的相關關系進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院2001年1月～2009年8月住院接受治療的宮頸癌患者組織標本120份，患者年齡33～57歲，平均（41.0±16.2）歲，病理標本的臨床分期參照2010年國際婦女產科協會FIGO分期系統分期。其中0期宮頸癌標本9份，Ⅰ期子宮頸癌標本27份，Ⅱ期宮頸癌標本44份，Ⅲ期宮頸癌標本30份，Ⅳ期宮頸癌標本10份；病理分化程度：低分化癌71例，中分化癌19例，高分化癌30例，選擇同期婦科門診女性宮頸活檢組織標本120份作為對照組，對照組年齡31～59歲，平均（44.1±15.6）歲，兩組間年齡無顯著差異，具有可比性。

1.2 主要儀器及試劑

逆轉錄buffer、SYBR Green Ⅰ PCR buffer、dNTPs、Taq酶、TUNEL原位末端標記檢測試劑盒（美國GE公司）、Triton X緩沖液、PBS緩沖液、非免疫山羊血清、焦碳酸二乙酯、枸櫞酸緩沖液（南京建成生物工程研究所），石蠟切片機、ZZ17-20L恒溫水浴箱（上海精密儀器廠），光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），3900臺式高通量DNA合成儀、9700 PCR儀、7500全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1引物的設計 GenBank上查找HPV16、HPV18、HSV-2基因mRNA序列，Primer express 2.0 軟件設計特異性引物，DNA合成儀合成引物，R-HPV16上游引物5’-ATTAG TGACA ATAGACATTA-3’，下游引物5’-GGCTTTTGACAGTTAATA CA-3’，R-HPV18上游引物5’- ATTAG TGACA ATAGACATTA-3’，下游引物5’-GGTTTCTGCGCACGCA-3’，R- HSV-2上游引物 5’-TCG GTG CCC CCG GTA TGG TAT T -3’，下游引物5’- GC GTAC GGA CCG TCG TCA TCT A -3’。

1.3.2 mRNA的提取及逆轉錄 石蠟包埋病理組織8μm厚度連續切片，蛋白酶消化組織，75％乙醇清洗 RNA沉淀，再次溶解后 70℃水浴退火，Buffer OW2 400μL重懸沉淀，SPIN柱子洗脫，離心沉淀，75%乙醇清洗沉淀后進行逆轉錄。反應體系如下：5×逆轉錄buffer4μL，下游引物（10pmol/μL）0.4μL、dNTPs（10mM）0.5μL、MMLV （200U/μL）1μL、DEPC水10.1μL、RNA模板4μL。總體積：20μL，逆轉錄buffer成分：50mM Tris-HCl（pH8.0）、50mMKCl、4mM MgCl2、10mM DTT。

1.3.3 mRNA的熒光定量PCR反應 反應條件93℃ 3min，93℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 45s，共40個循環。反應體系：5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10μL上游引物F（10pmol/μL）1μL、下游引物R（10pmol/μL）1μL、dNTPs（10mM）1μL、Taq 酶（3U/μL）1μL、 cDNA 5μL、ddH2O31μL、總體積：50Μl PCR buffer成分：10mM Tris-HCl（pH 8.0），50mM KCl，2mM MgCl2，反應結束后取反應產物5L10μL做常規凝膠電泳分析（40V電泳6n）。

1.4 統計學處理

數據處理采用SPSS17.0漢化版軟件，數據記錄采用 [n（%）]，統計學方法采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者HPV16、HPV18、HSV-2感染情況比較

宮頸癌組HPV16、HPV18、HSV-2感染陽性率高于對照組，差異具有統計學意義。見表1。

2.2 兩組患者單獨感染及多重感染率比較

宮頸癌組感染率、單獨感染率及混合感染率高于對照組，差異具有統計學意義。見表2。

2.3 HPV16、HPV18、HSV-2多重感染與宮頸癌腫瘤分期的相關性

HPV16、HPV18、HSV-2單獨感染與多重感染與宮頸癌組織FIGO分期相關檢驗結果顯示，HPV16、HPV18、HSV-2多重感染與宮頸癌分期具有相關關系。見表3。

2.4 HPV16、HPV18、HSV-2多重感染與宮頸癌腫瘤分化的相關性

HPV16、HPV18、HSV-2單獨感染與多重感染與宮頸癌分化程度相關檢驗結果顯示，HPV16、HPV18、HSV-2多重感染與宮頸癌組織的分化程度存在相關關系。見表4。

3 討論

宮頸癌是常見的婦科腫瘤，宮頸癌的發生與生殖道的病毒感染密切相關，HPV是宮頸部位最常見的感染病毒， HPV感染能夠引起機體多種形式的損傷，宮頸感染HPV后病毒DNA能夠同宮頸上皮細胞DNA整合，激發自身的免疫系統，對病毒進行清除，但同時也引發局部的上皮損傷，引起宿主細胞的增殖異常[2]，發生不典型增生直至癌變。HPV的E系列蛋白與宮頸癌密切相關。E5蛋白能夠引起生長因子的信號級聯放大，動物實驗表明[3]，E5蛋白能夠通過配體依方式激活細胞生長因子受體，引起高危型HPV16感染的小鼠皮膚基底層細胞DNA過度合成、細胞異常增殖直至發生癌變。能夠通過影響生長因子的磷酸化過程延緩細胞生長因子的降解，并能夠上調生長因子受體的表達和功能，進而發揮促進細胞的增殖作用[4]。高危型的HPV的反復感染導致的上皮損傷是引發宮頸癌危險因素之一。HPV 16及HPV 18均是引發宮頸癌的高危亞型，研究結果顯示[5]，高危型HPV感染率的增加是導致我國宮頸癌發病年輕化和宮頸癌發病率上升的主要原因之一。

近年來研究顯示，HPV混合感染是常見的感染形式，多重感染能夠大大增加患者患宮頸癌的風險級別。HSV-2是宮頸組織常見的感染病毒，并且能夠增加宮頸癌的發病風險，最近的研究發現，HSV-2在宮頸癌的發生中并未單獨發生作用，HSV-2可能為宮頸癌HPV病因發病學中的輔助因素[6]。HSV-2感染能夠加速HPV復制，并增加整合HPV-DNA序列[7]，增加高危型HPV致癌的風險。在兩組資料的對比中發現，宮頸癌組的HPV16、HPV18、HSV-2單獨感染及多重感染的陽性率均高于對照組，提示HPV16、HPV18、HSV-2單獨感染及多重感染是宮頸癌的發病致病原因之一。

雖然病毒感染與宮頸癌的發病存在明確的相關關系，但是宮頸的病毒感染對宮頸癌進展的影響目前尚存在較大的爭議，大多數學者認為，HPV感染的病毒載荷量同宮頸上皮的病例損傷程度相關[8]，HPV的感染程度不同能夠導致宮頸病變進展的結果差異，我們在研究中發現，HPV16、HPV18、HSV-2多重感染同宮頸癌的分期及病理分化存在相關關系，說明病毒的多重感染可能是宮頸癌進展的危險因素，對此進行干預可能為宮頸癌提供良好的治療前景。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-07-12）