薯蕷皂苷元對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

[摘要] 目的 研究薯蕷皂苷元對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。方法 培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株Hela，不同濃度的薯蕷皂苷元干預(yù)24、48、72h，采用MTT、EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1。結(jié)果 薯蕷皂苷元在20μmol/L濃度時(shí)抑制Hela細(xì)胞活力（P＜0.01），呈現(xiàn)量效和時(shí)效特征；薯蕷皂苷元作用后EdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，薯蕷皂苷元引起G0/G1期細(xì)胞阻滯，減少S期細(xì)胞，降低Cyclin D1蛋白表達(dá)，而對(duì)Cyclin B1蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響。結(jié)論 薯蕷皂苷元通過(guò)阻滯細(xì)胞G0/G1期來(lái)抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞株的增殖。

[關(guān)鍵詞] 薯蕷皂苷元；宮頸癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）26-05-03

Influence of Diosgenin on Cell Proliferation in Human Cervical Cancer

ZHANG Wenxiu

Department of Obstetrics and Gynecology， the First People's Hospital of Jining City， Jining 272100， China

[Abstract] Objective To evaluate the possible effects of diosgenin on cell proliferation in human cervical cancer. Methods The Hela cells were treated with different concentrations of diosgenin for 24， 48 and 72 hours， respectively. Cell proliferation was tested by MTT and EdU assay， and cell cycle analysis was performed by FACS. In addition， Cyclin D1 and B1 protein expressions were tested by Western Blotting， respectively. Results We found that 20 μmol/L diosgenin began to markedly inhibit cell viability （P＜0.01） and there were dose-dependent and time-dependent effects of diosgenin on cell viability. We found that the number of EdU+ cells （EdU-labeled replicating cells） was significantly reduced in diosgenin treatment group. Diosgenin decreased expression of cyclin D1 and arrested them at the G0/G1 phase. Conclusion Diosgenin inhibits the proliferation of human cervical cancer cells by blocking them at the G0/G1 phase.

[Key words] Diosgenin； Cervical cancer； Cell proliferation； Cell cycle

現(xiàn)代藥理研究表明薯蕷皂苷及其衍生物具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗關(guān)節(jié)炎、保護(hù)胃黏膜、祛痰、溶血、脫敏、滅釘螺、抗腫瘤、抗艾滋病、抗血小板聚集、增強(qiáng)心臟收縮力、減慢心率、抗動(dòng)脈硬化、改善微循環(huán)等多種藥理活性[1，2]。宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)；近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)化療在宮頸癌的應(yīng)用進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床方面研究，取得較大進(jìn)展。本研究觀(guān)察薯蕷皂苷元對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞株增殖和細(xì)胞周期的影響，探討其對(duì)治療宮頸癌的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司，用含10%新生牛血清（NBS，Gibco，USA）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，USA）培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)條件：5%CO2，95%空氣，溫度37℃，濕度98%。細(xì)胞在培養(yǎng)皿中密度達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.2 薯蕷皂苷元貯存液配制

原粉為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，按照說(shuō)明書(shū)要求，溶于酒精配制100mM貯存液，無(wú)菌分裝-80℃保存?zhèn)溆谩９ぷ饕壕凭珴舛?.5%。分組實(shí)驗(yàn)，無(wú)菌吸取貯存液加入饑餓培養(yǎng)液中，稀釋為15μM、20μM、25μM、30μM。

1.3 細(xì)胞活力的測(cè)定

細(xì)胞密度培養(yǎng)至70%～80%，消化后轉(zhuǎn)至96孔板（每孔細(xì)胞數(shù)約1×104），含10% NBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3d，含0.2% NBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（同步化）24h，之后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)干預(yù)階段。對(duì)照組與薯蕷皂苷元15μM組、20μM組、25μM組、30μM組，分別作用24h、48h和72h；采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力（中國(guó)凱基，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒）。Dilution Buffer將5×MTT稀釋成1×MTT；每孔加1×MTT 50μL，37℃孵育4h，MTT還原為甲臜；吸出上清液，每孔加DMSO 150μL溶解甲臜，平板搖床搖勻；酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。

1.4 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔6000～10000細(xì)胞接種于96孔板，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行藥物處理，對(duì)照組與25μM薯蕷皂苷元作用6h、12h；采用EdU試劑盒（中國(guó)銳博，C00031 Apolloreg;567）檢測(cè)細(xì)胞增殖，熒光顯微鏡下所有細(xì)胞核顯示藍(lán)色（Hoechst染色），增殖中的細(xì)胞核顯示紅色（EdU染色）。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

對(duì)照組與25μM薯蕷皂苷元作用24h、48h；細(xì)胞干預(yù)消化結(jié)束，PBS洗后離心，0.4mL PBS重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎），加50μL PI至終濃度為65μg/mL，冰浴中避光染色30min；300目（孔徑40～50μm）尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

對(duì)照組與25μM薯蕷皂苷元作用6h、12h；細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于直徑4cm的培養(yǎng)皿，分組培養(yǎng)不同時(shí)間后提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，采用Western Blot檢測(cè)Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表達(dá)水平。抗體：小鼠單克隆β-actin一抗（Abcam，6926），小鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體（sc-8396），兔抗人Cyclin B1單克隆抗體（Abcam，4138），山羊抗小鼠-HRP標(biāo)記抗體（ZB2305）購(gòu)自北京中杉公司，小鼠抗兔-HRP標(biāo)記抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析與t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

20μmol/L薯蕷皂苷元作用24h后，開(kāi)始明顯抑制宮頸癌Hela的細(xì)胞活力（P＜0.05），呈現(xiàn)量效和時(shí)效的影響，隨著薯蕷皂苷元濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果明顯增強(qiáng)。根據(jù)MTT結(jié)果和參考文獻(xiàn)，選用25μmol/L濃度的薯蕷皂苷元進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度薯蕷皂苷元對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞活力的影響

2.2 EdU結(jié)果

EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（即增殖期細(xì)胞）在薯蕷皂苷元處理6h和12h后明顯減少；作用12h EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少更明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

25μmol/L薯蕷皂苷元阻滯細(xì)胞在G0/G1期，S期細(xì)胞減少（P＜0.05）；G2/M期細(xì)胞沒(méi)有明顯變化。作用24h和48h，兩者之間無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

25μmol/L薯蕷皂苷元作用6h后對(duì)Cyclin D1蛋白水平無(wú)明顯影響；作用12h后降低Cyclin D1蛋白的水平；Cyclin B1蛋白水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖3。

圖3 薯蕷皂苷元對(duì)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1的影響

3 討論

子宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療方案認(rèn)為宮頸癌對(duì)化療藥物不敏感，僅在晚期和復(fù)發(fā)患者中將化療作為綜合治療一部分。近年來(lái)大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，化療在宮頸癌的治療中，對(duì)局部治療手段不能控制的腫瘤周?chē)⑷庋劭床坏降奈⑿∞D(zhuǎn)移灶以及可能存在的全身亞臨床轉(zhuǎn)移有一定療效，進(jìn)而確定化療在治療宮頸癌的地位。化療藥物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡起到抗腫瘤作用，因此尋找新的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡的藥物，成為治療宮頸癌的新策略。

國(guó)外研究表明薯蕷皂苷元具有顯著抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。體內(nèi)抗腫瘤的效用方面，Malisetty等[3]報(bào)道在嚙齒動(dòng)物結(jié)腸癌模型中，薯蕷皂苷元在起始、始發(fā)、進(jìn)程中能夠抑制結(jié)腸癌前病變，表明它可以有效推遲和終止結(jié)腸癌前病變的出現(xiàn)和發(fā)展。Raju等[4]研究也證實(shí)，薯蕷皂苷元阻止結(jié)腸癌變?cè)缙陔A段的進(jìn)程。此外，體外抗腫瘤效用方面，Shishodia等[5]檢測(cè)體外的薯蕷皂苷元對(duì)60種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系/株的細(xì)胞毒作用，結(jié)果顯示薯蕷皂苷元的細(xì)胞毒作用可對(duì)抗NCI人類(lèi)腫瘤的白血病、實(shí)體瘤等大多數(shù)細(xì)胞株。MTT結(jié)果提示薯蕷皂苷元抑制宮頸癌Hela細(xì)胞活力，15μmol/L薯蕷皂苷元作用24h后不能明顯抑制細(xì)胞活力，20μmol/L薯蕷皂苷元作用24h開(kāi)始明顯抑制宮頸癌Hela的細(xì)胞活力，隨著濃度增加抑制作用更加明顯，呈現(xiàn)量效和時(shí)效作用；根據(jù)MTT和其他文獻(xiàn)結(jié)果，采用25μM薯蕷皂苷元進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)及下一步實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明其抑制宮頸癌Hela細(xì)胞株增殖的作用。

Cyclin D1在G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起重要作用，是細(xì)胞DNA合成以及通過(guò)G1/S期檢測(cè)點(diǎn)的正向調(diào)控因子；Cyclin B1是典型G2/M期周期蛋白，促進(jìn)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期完成有絲分裂。研究結(jié)果表明薯蕷皂苷元阻滯細(xì)胞G0/G1期，減少S期細(xì)胞；25μmol/L薯蕷皂苷元作用6h對(duì)Cyclin D1蛋白水平無(wú)明顯影響，作用12h和48h后Cyclin D1蛋白水平降低；薯蕷皂苷元對(duì)Cyclin B1蛋白水平影響無(wú)明顯差異，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，薯蕷皂苷元能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞株增殖，通過(guò)降低Cyclin D1蛋白表達(dá)而引起G0/G1期細(xì)胞阻滯，薯蕷皂苷元抑制增殖作用有明顯的量效和時(shí)效影響。遺憾的是，由于時(shí)間所限制沒(méi)有進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路的研究，我們將在下一步實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)研究薯蕷皂苷元影響宮頸癌Hela細(xì)胞株的信號(hào)通路。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2011-08-01）