艾葉總黃酮的提取及純化工藝條件

2011-12-31 00:00:00申湘忠

湖北農業科學 2011年12期

摘要：以總黃酮的吸附率、解吸率為指標，采用可見分光光度計測定總黃酮的含量，考察ＡＢ－８型大孔吸附樹脂對艾葉總黃酮的最佳純化條件。結果表明，最佳吸附條件為樣液濃度０．３１１ｍｇ／ｍＬ，吸附速率１．０ｍＬ／ｍｉｎ，樣液ｐＨ值２，上樣量每克大孔樹脂５ｍｇ粗黃酮溶液；最佳解吸條件是４倍床體積、體積分數為７０％的乙醇，以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脫。艾葉總黃酮的含量（質量分數）在未經純化之前為１９．３％，在最佳條件下純化之后可達６０．１％，約是原來含量的３．１倍。

關鍵詞：艾葉；總黃酮；大孔吸附樹脂；提取；純化

中圖分類號：Ｑ９４９．７８３．５；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2519-03

Study on the Extracting and Purifying Conditions of Total Flavonoids from Argy Wormwood Leaves

ＳＨＥＮＸｉａｎｇ－ｚｈｏｎｇ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｕｍａｎｉｔｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｏｕｄｉ４１７０００，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍａｒｇｙｗｏｒｍｗｏｏｄｌｅａｖｅｓｂｙＡＢ－８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｕｓｉｎｇａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｉｏａｎｄｅｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｓｅｖａｌｕａｔｉｎｇｃｒｉｔｅｒｉａ．ＡｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＶｉｓｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｓｏｌｕｂｌｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔ，０．３１１ｍｇ／ｍＬ；ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅ，１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｐＨ，２；５ｍｇｃｒｕｄｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｐｅｒ１ｇｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ．Ｔｈｅｂｅｓｔｅｌｕｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓ４ＢＶ，７０％（V/V）ａｌｃｏｈｏｌａｔａｒａｔｅｏｆ１．０ｍＬ／ｍｉｎ．Ａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｃｏｕｌｄｒｅａｃｈｅｄｔｏ６０．１％，ｗｈｉｃｈｗａｓ３．１ｔｉｍｅｓｏｆｔｈａｔｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ（１９．３％）．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｇｙｗｏｒｍｗｏｏｄｌｅａｖｅｓ；ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

總黃酮廣泛存在于自然界的某些植物和果漿中，總數大約有４千多種，其分子結構不盡相同，如蕓香苷、橘皮苷、櫟素、綠茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都屬總黃酮。總黃酮的功能是多方面的，它具有消除氧自由基、抗氧化、調節血脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性，同時總黃酮具有抗潰瘍、抗過敏、抗菌、抗炎、抗衰老、降血脂、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣闊開發前景的天然抗氧化劑［１－７］。另外，在食品工業上可作色素用［６］。

生物類黃酮（Ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）亦稱維生素Ｐ，常與維生素Ｃ伴存，在自然界分布廣泛，屬植物次級代謝產物，是一組存在于蔬菜、水果、花和谷物中的天然色素，因多呈黃色而稱生物類黃酮。大孔吸附樹脂物理化學穩定性高、吸附選擇性獨特、不受有機物存在的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、宜于構成閉路循環、節省費用等，廣泛用于生化和天然物質的分離提純［8，9］。鄭亞杰等［１0－１5］的研究表明，ＡＢ－８型大孔吸附樹脂對總黃酮有較好的吸附效果。試驗主要研究用ＡＢ－８型大孔吸附樹脂純化艾葉總黃酮的最佳工藝條件，其中考慮的主要因素是樣液濃度、吸附速率、樣液ｐＨ值、上樣量對吸附率的影響，洗脫劑體積分數、洗脫速率、洗脫劑用量對解吸率的影響。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１儀器ＦＡ２００４型電子天平；１０１－２ＡＢ型電熱鼓風干燥箱；ＲＥ－５２Ｄ旋轉蒸發器；ＷＦＪ７２００型可見分光光度計；玻璃層析柱（１５ｍｍ×２００ｍｍ）；ｐＨＳ－３Ｃ數字酸度計；ＳＨＺ－Ｄ循環水式真空泵。

１．１．２藥品艾葉（購于婁底藥店）；ＡＢ－８型大孔吸附樹脂（天津市光復精細化工研究所）；蘆丁（上海化學試劑公司）；氫氧化鈉；亞硝酸鈉；硝酸鋁；鹽酸；無水乙醇；體積分數為９５％的乙醇；石油醚；乙醚。以上試劑均為分析純。

１．２方法

１．２．１粗黃酮的提取取一定量的艾葉，將其洗凈，把水晾干，然后放入干燥箱中，在５０ ℃下烘干。再用粉碎機將其磨成碎末。稱取一定量的艾葉碎末按以下方法脫色和脫脂。以無水乙醚為脫脂劑，在４５ ℃水浴下脫脂約２０ｈ，充分除去樣品中脂類和脂溶性色素，當用玻璃棒蘸一滴剛要發生虹吸時的浸提液于濾紙上，而濾紙上沒有油斑，可認為脫脂完全，再放入干燥箱中５０℃烘干。將脫過脂的樣品放入圓底燒瓶中，加入體積分數為７０％的乙醇溶液，回流浸提８次，每次２ｈ左右，且前４次樣品的質量（ｇ）與乙醇的體積（ｍＬ）比為１∶８，后４次為１∶６，最后一次浸提液幾乎無色，說明浸提基本完成。合并８次浸提液，放入分液漏斗中，用石油醚進行二次脫脂，收集二次脫脂過的粗黃酮提取液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至一定體積，再放入真空干燥箱中干燥得到粗黃酮粉末。

１．２．２標準曲線的建立精密稱取蘆丁對照品５０．３ｍｇ置于１００ｍＬ容量瓶中，加體積分數為６０％的乙醇溶解，定容至刻度。精密吸取該溶液５０ｍＬ于１００ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，得濃度為０．２５２ｍｇ／ｍＬ的蘆丁對照品溶液。分別精密吸取該蘆丁對照品溶液０．０、２．０、５．０、８．０、１２．０、１６．０ｍＬ于５０ｍＬ容量瓶中，各加體積分數為３０％的乙醇４ｍＬ，６ g/L亞硝酸鈉２ｍＬ，放置６ｍｉｎ后加１０ g/L硝酸鋁溶液２ｍＬ，同樣放置６ｍｉｎ后加入１０ g/L氫氧化鈉溶液２０ｍＬ，補加３０％乙醇至５０ｍＬ，放置１５ｍｉｎ。用分光光度計于５０８ｎｍ波長處測定吸光度，由此可作出標準曲線，并計算出線性回歸方程。

由標準曲線可以計算得回歸方程為Ａ＝９．９７８８Ｃ＋０．０１１８，其中Ｃ為蘆丁對照品溶液的濃度（ｍｇ／ｍＬ），相關系數ｒ＝０．９９８９。

１．２．３ＡＢ－８型大孔吸附樹脂的預處理稱取約１６ｇ的ＡＢ－８型大孔吸附樹脂按照以下步驟對其進行處理。先用９５％的乙醇充分浸泡２４ｈ后裝柱，然后用９５％的乙醇洗至加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗至無醇味后加入大約４倍床體積的體積分數為５％的ＨＣｌ浸泡３～４ｈ，用去離子水洗至中性，再加入大約４倍床體積的為５ g/L的ＮａＯＨ溶液浸泡３～４ｈ，最后用去離子水洗至中性即可使用。

１．２．４粗黃酮中總黃酮含量的測定稱取３２．７ｍｇ的粗黃酮，在９０ ℃用去離子水溶解，然后用離心機３５００ｒ／ｍｉｎ離心，取上層清液配成５０ｍＬ溶液，再取１０ｍＬ該溶液于５０ｍＬ容量瓶中，按步驟１．２．２的方法測得總黃酮含量為１９．３％。

２結果與分析

２．１樣液濃度對吸附率的影響

稱取６５７．１ｍｇ粗黃酮在９０ ℃水浴中用去離子水溶解，３５００ｒ／ｍｉｎ離心后取上層清液配成２５０ｍＬ溶液，均分成５份，再分別稀釋至濃度為０．０６６、０．２１７、０．３１１、０．４１３、０．５０７ｍｇ／ｍＬ的溶液。然后將它們均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，分別用３倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同樣液濃度下的吸附率（圖２）。由圖２可以看出，當樣液濃度小于０．３１１ｍｇ／ｍＬ時，隨著樣液濃度的增大，吸附率也增大；當樣液濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ時，吸附率達到最大值，隨后隨著樣液濃度的增大，吸附率減小。所以，上樣時應使樣液濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ。

２．２吸附速率對吸附率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液５００ｍＬ，均分成５份，分別以０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，并用３倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同吸附速率下的吸附率如圖３。由圖３可以看出，隨著吸附速率的增大，吸附率逐漸降低，但當吸附速率太小時花費的時間就會很多，并且當吸附速率由０．５ｍＬ／ｍｉｎ增大到１．０ｍＬ／ｍｉｎ時，吸附率只是略微降低，卻節省了１／２的時間；而當吸附速率大于１．０ｍＬ／ｍｉｎ時，雖然花費的時間減少了，但吸附率卻急劇下降。綜合考慮以上因素，選擇吸附速率為１．０ｍＬ／ｍｉｎ比較合適。

２．３樣液ｐＨ值對吸附率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液５００ｍＬ，均分成５份，用５％的ＨＣｌ將它們的ｐＨ值分別調至１、２、３、４、５，然后均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，再用３倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按照步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同ｐＨ值下的吸附率如圖４。據圖４可看出，當ｐＨ值小于２時，隨著樣液ｐＨ值的增大，吸附率相應地增大；當ｐＨ值大于２后，隨著ｐＨ值的增大，吸附率明顯地降低；當ｐＨ值為２時吸附率可達最大值。因此過柱前要調好溶液的酸堿度，使其ｐＨ值為２，以便增大大孔樹脂對總黃酮的吸附能力。

２．４上樣量對吸附率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液１５００ｍＬ，分別從中取出總黃酮量為４０、６０、８０、１００、１２０ｍｇ的溶液，均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，并用３倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同上樣量下的吸附率如圖５。由圖５可知，當上樣量小于６０ｍｇ時，隨著上樣量的增加，吸附率略有減小；上樣量在６０～８０ｍｇ之間時，隨著上樣量的增加，吸附率略有增大；上樣量大于８０ｍｇ后，隨著上樣量的增加，吸附率明顯減小。總體上看，上樣量為４０～８０ｍｇ時，吸附率變化不大；雖然上樣量小有利于吸附，但上樣量太小，大孔樹脂的利用率太低。因此，當上樣量為８０ｍｇ時，既能保持較大的吸附率，又使得大孔樹脂的利用率較高。根據所用大孔樹脂的量為１６ｇ來計算，可算出平均每克大孔樹脂的上樣量為５ｍｇ時，吸附率和大孔樹脂的利用率都比較高。所以，試驗前要根據所用大孔樹脂的量來確定上樣量，使平均每克大孔樹脂的上樣量為５ｍｇ。

２．５洗脫劑體積分數對解吸率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液５００ｍＬ，均分成５份，均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，分別用３倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，再用４倍床體積的體積分數分別為３０％、５０％、７０％、８０％、９０％的乙醇溶液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脫，收集洗脫液。按步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同體積分數的洗脫劑下的解吸率如圖６。

由圖６可以看出，當洗脫劑體積分數小于７０％時，隨著洗脫劑體積分數的增大，解吸率也增大；當洗脫劑體積分數為７０％時，解吸率達最大值；當洗脫劑體積分數大于７０％后，隨著洗脫劑體積分數的增大，解吸率逐漸減小。所以，洗脫時用體積分數為７０％的乙醇，洗脫效果最好。

２．６洗脫速率對解吸率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液５００ｍＬ，均分成５份，均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，分別用３倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，再用４倍床體積的體積分數為７０％的乙醇溶液洗脫，洗脫速率分別為０．５、１．０、２．０、３．０、４．０ｍＬ／ｍｉｎ，收集洗脫液，按步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同洗脫速率下的解吸率如圖７。由圖７可看出，隨著洗脫速率的增大，解吸率減小，因此，按說洗脫速率小有利于解吸率的增加；但洗脫速率太小就需要花費很多時間。同時由圖７可以看出，洗脫速率在０．５～１．０ｍＬ／ｍｉｎ之間解吸率大，且隨著洗脫速率的增加，解吸率降低很小，卻節省了１／２的時間；而當洗脫速率大于１．０ｍＬ／ｍｉｎ時，雖然所用時間減少，但解吸率急速減小。考慮以上因素，將洗脫速率定為１．０ｍＬ／ｍｉｎ比較合適。

２．７洗脫劑用量對解吸率的影響

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液５００ｍＬ，均分成５份，均以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，分別用３倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，分別用２、３、４、５、６倍床體積的體積分數為７０％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，按步驟１．２．２的方法測量其中的總黃酮含量，據此計算出不同用量洗脫劑下的解吸率如圖８。由圖８可看出，洗脫劑用量從２倍床體積增加到４倍床體積時，解吸率顯著增大；洗脫劑用量大于４倍床體積時，隨著洗脫劑用量的增加，解吸率幾乎不再變化。因此，洗脫劑用量為４倍床體積時，洗脫效果最好。

２．８最佳條件下的純化效果

配制濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ的粗黃酮溶液２５０ｍＬ，ｐＨ值調為２，以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率過柱，用３倍床體積的水洗柱，再用４倍床體積的體積分數為７０％的乙醇溶液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脫，將洗脫液用旋轉蒸發儀濃縮到一定體積，再減壓干燥成粉末。然后按步驟１．２．２的方法測得其總黃酮的含量為６０．１％，約是過柱前含量的３．１倍。

３結論

用ＡＢ－８型大孔吸附樹脂為吸附劑對粗黃酮進行純化，受到各種因素的影響，包括樣液濃度、吸附速率、樣液ｐＨ值、上樣量對吸附率的影響及洗脫劑體積分數、洗脫速率、洗脫劑用量對解吸率的影響，這些因素對純化效果有很大的影響。研究發現，當樣液濃度為０．３１１ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ值為２，吸附速率為１．０ｍＬ／ｍｉｎ，上樣量為每克大孔樹脂５ｍｇ粗黃酮溶液，吸附率可達最大值；再用４倍床體積的體積分數為７０％的乙醇溶液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脫可使解吸率達到最大值。當吸附率和解吸率都達到最大值時，即為試驗所需的最佳條件。在最佳條件下，通過ＡＢ－８型大孔吸附樹脂的純化，使得粗黃酮中的總黃酮含量由原來的１９．３％增大到６０．１％，是原含量的３．１倍。

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