篦子三尖杉內生真菌gyzy-9的鑒定及其抑菌活性研究

摘要：為研究瀕危藥用植物篦子三尖杉（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ）內生真菌ｇｙｚｙ－９的發酵產物及其抑菌活性，對其發酵產物進行了ＨＰＬＣ分析，并對其抑菌活性進行了紙片法檢測，同時還對菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列進行了聚類分析。ＨＰＬＣ分析結果表明，菌株ｇｙｚｙ－９能夠產生高三尖杉酯堿（Ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ），其發酵液對表皮葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、提取物對枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的抑菌效果較強，抑菌圈直徑均大于１５ ｍｍ。對ｇｙｚｙ－９菌株ＩＴＳ序列的系統發育聚類分析結果表明，ｇｙｚｙ－９為平革菌屬（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ．）真菌。對此菌株的研究為進一步研發生產三尖杉藥用活性成分提供了條件。

關鍵詞：篦子三尖杉；內生真菌；高三尖杉酯堿；高效液相色譜

中圖分類號：Ｒ９３；Ｑ９３９．９３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2449-04

Identification and Antimicrobial Activity Analysis of Endophytic Fungi Strain

gyzy-9 from Cephalotaxus oliveri

ＨＡＮ Ｊｉｅ１，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ－ｈｏｎｇ２

（１． Ｌａｂ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００２，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００８１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ the ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｔｒａｉｎ ｇｙｚｙ－９ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ， ａ ｒａｒｅ ａｎｄ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｐｌａｎｔ， ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ） ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｙｚｙ－９ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＨＰＬＣ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｙｚｙ－９ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ． Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｆｅｒｍｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｐｅｌｌｅｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ was ｓｔｒｏｎｇｅｒ as ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ was wider ｔｈａｎ １５ ｍｍ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｙｚｙ－９ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ． ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ waｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ； endophytic fungus； homoharringtonine； HPLC

植物內生菌是一種多樣性十分豐富的微生物類群，生活在健康植物組織內部，與宿主植物長期協同進化，在與宿主植物長期共存的過程中，能形成產生與宿主植物相同或相似生物活性物質的能力。藥用植物內生真菌活性成分的研究，如小檗堿［１］、紫杉醇［２］、細胞松弛素［３］、鬼臼毒素［４］、長春新堿［５］、喜樹堿［６］等已有相關報道。

三尖杉屬植物（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｓｐｐ．）為珍稀藥用植物，其種子和枝葉是生產抗白血病藥物三尖杉酯堿（ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎ，ＨＲＴ）和高三尖杉酯堿（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎ，ＨＨＴ）的原料［７］。但是，藥用植物資源的短缺和濫砍濫伐的破壞，限制了以三尖杉為原料的酯堿類藥物的生產。對三尖杉內生菌及其活性物質的開發利用，可以彌補資源短缺、保護生態平衡，并且能夠通過對其代謝產物中活性物質的提取，降低生產成本。在前期已從瀕危藥用植物篦子三尖杉的枝葉中分離出了２０多株內生真菌的基礎上，該試驗通過ＨＰＬＣ分析獲得了１株產高三尖杉酯堿的內生真菌菌株ｇｙｚｙ－９，并對其進行了分子鑒定及產物抑菌活性分析，為進一步挖掘三尖杉內生真菌發酵產物的藥用活性物質打下基礎。

１材料與方法

１．１材料和試劑

內生真菌ｇｙｚｙ－９分離自篦子三尖杉植株，保存于貴陽中醫學院微生物教研室；高三尖杉酯堿標準品購自陜西辰光生物公司；大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腐生葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、表皮葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、產氣桿菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ）、變形桿菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）均由貴陽醫學院微生物教研室提供，菌種存于貴陽中醫學院形態實驗室。

超聲波細胞破碎儀（寧波新芝，ＪＹ０２－２Ｄ）；高效液相色譜儀（ＨＰＬＣ）（日本，Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０Ａ），檢測器ＳＰＤ－２０Ａ，Ｃ１８色譜柱２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ；色譜純甲醇為天津大茂試劑；水為０．４５ μｍ濾膜過濾的蒸餾水；其他試劑為市售分析純。ＰＤＡ培養基和ＮＡ培養基按常規方法配制。

１．２方法

１．２．１發酵產物提取和ＨＰＬＣ分析將分離的內生真菌ｇｙｚｙ－９接種至裝有１００ ｍＬ液體ＰＤＡ培養基的２５０ ｍＬ三角瓶中，室溫下１３０ ｒ/min振蕩培養，７ ｄ后用超聲波細胞破碎儀破碎發酵液中的菌絲球，時間為４ ｍｉｎ，打擊時間４ ｓ，間隔時間４ ｓ，功率４００ ｗ。將經超聲波處理后的發酵液５ ０００ ｒ/min離心１５ ｍｉｎ后取上清液，在６０ ℃水浴中濃縮至原體積的１／２０，加無水Ｎａ２ＣＯ３調ｐＨ值為９，加入二氯甲烷達原始上清液體積后充分混合靜置１ ｈ以上，５ ０００ ｒ/min離心１５ ｍｉｎ，取下層沉淀，自然揮發干，得到提取物。將提取物用５ ｍＬ甲醇溶解定容。對各菌株發酵產物提取物中的生物堿進行分析，ＨＰＬＣ流動相ＣＨ３ＯＨ∶Ｈ２Ｏ（體積比）＝２∶３，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，進樣量１０ μＬ，柱溫３０℃，運行時間１５ ｍｉｎ。

１．２．２ＩＴＳ 序列擴增發酵培養的菌絲球經抽濾至干后，加液氮快速研磨，然后用ＤＮＡ 提取試劑盒提取ＤＮＡ，分光光度計法測定ＤＮＡ純度和濃度。采用引物ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′） 和ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）擴增ＩＴＳ區。ＰＣＲ反應體系：ＤＮＡ聚合酶２．５ Ｕ，１０×ＰＣＲ緩沖液５ μＬ，ｄＮＴＰ ２ μＬ，引物各２ μＬ，模板ＤＮＡ ２ μＬ，加水至５０ μＬ。反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３０個循環；７２ ℃延長１０ ｍｉｎ。將ＰＣＲ產物進行１％瓊脂糖凝膠電泳，電泳產物直接送生工生物工程（上海）有限公司測序。

１．２．３ＩＴＳ序列分析將測定所得的ＩＴＳ序列在ＧｅｎBａｎｋ用Ｂｌａｓｔｎ進行同源性比較，選擇同源性較近的序列構建系統發育樹。應用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １．８３ 對選擇的序列進行排列，再用Ｓｅｅｖｉｅｗ將排列結果中的冗余序列剔除，最后輸入Ｍｅｇａ ４．０ 軟件，采用鄰接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－jｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）構建系統發育樹，自展法檢測其可靠性，自展數據集為１ ０００次。根據內生真菌的形態特征和ＩＴＳ序列系統發育樹，對內生真菌進行種屬分類和多樣性分析。

１．２．４抑菌試驗將菌株接種至裝有５００ ｍＬ液體ＰＤＡ培養基的１ ０００ ｍＬ三角瓶中，室溫下１３０ ｒ/min振蕩培養，７ ｄ后取發酵液上清液，濃縮至５ ｍＬ備用。菌絲球超聲波破碎后加等體積甲醇，無水Ｎａ２ＣＯ３調ｐＨ值為９，４ ℃冰箱過夜，濃縮至５ ｍＬ備用。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌分別制成１×１０５～１×１０７個／ｍＬ菌懸液，取３０ μＬ加入無菌ＮＡ培養基中用涂布棒將其均勻涂布，制成含菌平板，然后將無菌紙片（Φ＝６ ｍｍ）放入發酵液和提取液中浸泡３０ ｍｉｎ后，均勻分散放置于含菌平板上。每個平板放５片濾紙片。將制備好的平板置于３７ ℃恒溫培養１８ ｈ后觀察，測其抑菌圈直徑。

２結果和分析

２．１高三尖杉酯堿色譜分析

對６０ μｇ／ｍＬ的高三尖杉酯堿標準品在２９１ ｎｍ波長下進行ＨＰＬＣ分析，發現高三尖杉酯堿標準品的峰型對稱，響應值較高，保留時間為２．５３２ ｍｉｎ（圖１ａ）。經連續進樣５次分析，保留時間的ＲＳＤ為１．１４％，穩定性和精密度較好。將分離自葉片的ｇｙｚｙ－９菌株的發酵產物進行ＨＰＬＣ分析發現在２．５３６ ｍｉｎ（圖１ｂ）出現與高三尖杉酯堿標準品的保留時間基本一致的吸收峰，表明ｇｙｚｙ－９菌株的發酵產物含有高三尖杉酯堿成分。

２．２菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列聚類分析

利用通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４對內生真菌ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列進行ＰＣＲ擴增，獲得６１８ ｂｐ的單一ＤＮＡ條帶，測序結果提交ＧｅｎＢａｎｋ數據庫進行Ｂｌａｓｔｎ檢索，發現菌株ｇｙｚｙ－９與平革菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔ ｅｓｏｒｄｉｄａ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＵ０４７８０６）的ＩＴＳ序列覆蓋率達到９８％，同源性高達９７％。選取同源性較高的序列與菌株ｇｙｚｙ－９用ＮＪ法聚類分析，構建了系統發育樹（圖２），表明菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列與平革菌屬遺傳距離最近，證明內生真菌ｇｙｚｙ－９菌株屬于平革菌屬。

２．３ｇｙｚｙ－９抑菌活性分析

ｇｙｚｙ－９菌株的抑菌實驗表明，其發酵液及其提取物對所選的試驗菌株（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌）均有抑制作用，其中ｇｙｚｙ－９發酵液上清液對表皮葡萄球菌有明顯的抑制作用，最大抑菌圈直徑可達２０ ｍｍ，最小也達到１５ ｍｍ（圖３ｃ），對枯草芽孢桿菌、腐生葡萄球菌及產氣桿菌的抑菌活性中等（表１），但最大抑菌圈仍可分別達到１１ ｍｍ、１３ ｍｍ及１２ ｍｍ。提取物對枯草芽孢桿菌有顯著的抑制效果，抑菌圈直徑為１９ ｍｍ（圖３ｅ）。通過上述試驗可以看出發酵產物中含有抑菌物質，并有一定的抑菌效果。

３討論

內生真菌在與植物長期協同進化中，其生物學特性為了適應內生環境可能發生了某些改變。在實驗室條件下培養內生真菌，往往因離開了宿主植物，生物發育過程受到一定影響，而不能產生孢子或雖能產生孢子但孢子量極少，在實驗室中采用傳統的微生物分類方法進行菌種鑒定存在一定困難。該試驗利用ＩＴＳ序列聚類分析，將此菌株初步鑒定為平革菌屬（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ．）真菌。關于平革菌屬，已有在環境有機物降解中發揮著重要作用的報道［８］。當在２９１ ｎｍ下用ＨＰＬＣ分析其發酵提取物時，發現ｇｙｚｙ－９在２．５３６ min的保留時間有明顯吸收峰，與６０ μｇ／ｍＬ的高三尖杉酯堿標準品的保留時間２．５３２ ｍｉｎ基本一致，說明ｇｙｚｙ－９中有高三尖杉酯堿成分。通過進一步的抑菌試驗證明此菌株的發酵液及提取物對試驗菌株均有一定的抑菌效果，特別是對表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌效果較明顯。這為下一步對此菌株產物的抗真菌、抗腫瘤的研究打下了一些基礎，為利用植物內生真菌，尋找新的藥用成分來源提供了參考。

參考文獻：

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［８］ 徐淑霞，張世敏，尤曉顏，等． 黃孢原毛平革菌對黃瓜連作土壤酚酸物質的降解［Ｊ］．應用生態學報，２００８，１９（１１）：２４８０－２４８４．

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