枯草芽孢桿菌X-4對土壤青枯菌消長變化及防病效果的影響

摘要：為研究枯草芽孢桿菌Ｘ－４在土壤中的定殖動態對青枯菌消長變化的影響，以及對番茄青枯病的防治效果，采用綠色熒光蛋白基因標記法，通過番茄盆栽試驗直接測定了其在土壤中的定殖效果及對青枯病病原菌數量、土壤微生物功能多樣性及生物量的影響。結果表明，通過綠色熒光蛋白基因標記法能成功跟蹤菌株Ｘ－４在土壤中的定殖狀況，其定殖曲線表現為一非對稱拋物線，前期緩慢上升，２４ ｄ達到高峰，當接種量為５．０×１０５、１．０×１０６ＣＦＵ／（ｇ土）時，其定殖峰值分別為２．９８×１０７ＣＦＵ／（ｇ土）和５．０３×１０７ＣＦＵ／（ｇ土），而青枯菌數量則呈現出與Ｘ－４相應的消長變化，處理土壤青枯菌數量在１２～30 ｄ時段內呈現下降的趨勢，而對照病菌數量處于較高水平并且還有上升趨勢，因此未接種菌株Ｘ－４處理發病早，病指高；接種微生物菌劑Ｘ－４對土壤微生物功能多樣性無不利影響，并能有效地抑制病菌，對番茄青枯病表現出明顯的防治效果，接種量為１．０×１０６ＣＦＵ／（ｇ土）時，３５、４５、５５ ｄ對青枯病的防效分別為１００％、８３．３％和５７．２％；接種Ｘ－４還能促進番茄植株生長，增加生物量，促進結果。綠色熒光蛋白標記法可為枯草芽孢桿菌Ｘ－４在土壤中的動態變化提供直接的菌量數據，其數量與土壤中青枯菌數量的消長動態對番茄青枯病的防治效果有重要影響。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌Ｘ－４；定殖；消長動態；番茄青枯病；防病效果

中圖分類號：Ｑ９３９．９６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2425-03

Effect of Inoculating Bacillus subtilis X-4 on Ralstonia solanacearum in Soil and Controlling Tomato Bacterial Wilt

ＸＩＡＯ Ｘｉａｎｇ－ｚｈｅｎｇ１，ＬＩＵ Ｋｅ－ｘｉｎｇ２，ＬＩＡＯ Ｚｏｎｇ－ｗｅｎ２，ＤＵ Ｊｉａｎ－ｊｕｎ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｚｈｏｎｇｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２２５， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｎｅｗ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｘ－４ ｏｎ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ tomato bacterial wilt ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｇｆｐ） ｍａｒｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘ－４ ｉｎ ｓｏｉｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｒａｃｋｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｙ ｇｆｐ ｍａｒｋｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｎ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｐａｒａｂｏｌａ， ａｓ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｐｈａｓｅ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｐｏｉｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ２４ｔｈ ｄａｙ． Ｔｈｅ ｐｅａｋ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ２．９８×１０７ CFU/ｇ ａｎｄ ５．０３×１０７ CFU/ｇ ｄｒｙ ｓｏｉｌｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ when ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ Ｘ－４ ａｔ ｔｈｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ５．０×１０５ ａｎｄ １．０×１０６ CFU/ｇ ｆｒｅｓｈ ｓｏｉｌ. Mｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｓｈｏｗｅｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｓｏｉｌ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｒｅｎｄ ａｔ ｌｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ Ｘ－４ ｆｒｏｍ １２ｔｈ ｔｏ 30ｔｈ ｄａｙ； but it ｋｅｐｔ ｏｎ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｒｅｎｄ in the control soil； ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ａｐｐｅａｒｅｄ ｅａｒｌｉｅｒ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓ． Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ Ｘ－４ ｈａｄ ｎｏ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂ，ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｄｏｓａｇｅ ｗａｓ １．０×１０６ CFU/ｇ ｆｒｅｓｈ ｓｏｉｌ， ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ the ３５ｔｈ， ４５ｔｈ ａｎｄ ５５ｔｈ ｄａｙ ｗａｓ １００％， ８３．３％ ａｎｄ ５７．２％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ Ｘ－４ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｏｍａｔｏ ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆｒｕｉｔ ｎｕｍｂｅｒｓ． Ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄａｔａ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｘ－４ ｉｎ ｓｏｉｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｆｐ ｍａｒｋｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ ｓｏｉｌ ｈａｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｘ－４； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃ； ｔｏｍａｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ； ｄｉｓｅａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ

微生物接種劑又稱生物肥料，是一類含有活體微生物，當應用于作物或土壤時，能夠在作物根際或體內定殖，并起到特定肥料效應的微生物制品［１］。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農作物對硝態氮、重金屬、農藥的吸收，凈化和修復土壤，降低農作物病害發生，促進農作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護環境，以及提高農作物產品品質和食品安全等方面表現出了不可替代的作用［２－４］。許多關于施用生物有機肥或生物菌劑防病的文獻多集中于研究防病效果和對土壤微生物多樣性調控指標等方面［５－７］。目前尚未有對防病菌株與病菌動態消長的研究，雖有一些通過對多樣性指數變化和防效對有益菌和病菌消長的分析和推測，但未有關于有益菌和病菌消長動態的直接證據。為此，研究采用綠色熒光蛋白基因（ｇｆｐ）對拮抗菌株Ｘ－４進行了標記，研究其接種后在土壤中的動態變化規律，同時研究了對應土壤中番茄青枯病病原菌數量變化，以期為菌株Ｘ－４防病效果提供直接的研究數據，為今后的機理研究和推廣應用提供科學根據；同時通過研究枯草芽孢桿菌Ｘ－４在土壤中的定殖規律，揭示其與青枯病病原菌的動態變化及防病效果之間的關系，為指導該菌在施肥防病中的應用提供科學依據。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｘ－４華南農業大學新肥料資源研究中心分離并保存，對青枯病病原菌具有拮抗作用。試驗所用菌株用含綠色熒光蛋白基因的載體ｐＧＦＰ４４１２標記，標記菌株攜帶ｇｆｐ和耐受濃度為１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素的抗性基因。標記菌株接種液含菌量≥２．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。

１．１．２青枯病病原菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）自華南農業大學試驗農場發病番茄植株分離，具有致病活性。接種液含菌量≥５．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。

１．１．３試驗作物番茄品種為益豐４號，為青枯病易感品種，從廣州市蔬菜研究所購入。

１．２方法

１．２．１試驗設計試驗為番茄盆栽，采用聚乙烯塑料盆，每盆裝土５ ｋｇ，試驗用土取自華南農業大學農場菜園土，系茄科作物連作土壤，為青枯病易發地，土壤基本養分狀況見表１。試驗共設３個處理：①ＣＫ．接種無菌水；②Ｔ１．接種Ｘ－４，５．０×１０５ＣＦＵ／（ｇ土）；③Ｔ２．接種Ｘ－４，１．０×１０６ＣＦＵ／（ｇ土），每處理６次重復，隨機排列。所有處理移苗時均接種青枯菌１．０×１０５ＣＦＵ／（ｇ土）。接種劑Ｘ－４和青枯菌根據發酵培養液含菌情況用無菌水稀釋到所需量，均勻澆到移栽穴中，與土充分混勻。試驗過程中各處理氮、磷、鉀施入量相等，即Ｎ １２０ ｍｇ／（ｋｇ土），Ｐ２Ｏ５ ８０ ｍｇ／（ｋｇ土），Ｋ２Ｏ １００ ｍｇ／（ｋｇ土），８０％肥料作基肥施用，２０％肥料待番茄移栽２０ ｄ后作追肥施用。番茄種子育苗前先用２％次氯酸鈉消毒２ ｍｉｎ，然后用無菌水反復沖洗，播種在小塑料盒中（盒中土壤由栽培基質和細肥土按１∶１比例混合而成），出苗２０ ｄ后移至栽種盆中，每盆兩株。

１．２．２土壤中Ｘ－４及青枯菌數量測定

１）枯草芽孢桿菌Ｘ－４。采用含１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素的ＰＤＡ培養基，并結合熒光顯微鏡觀察計數。

２）青枯菌。采用ＴＴＣ培養基［８］＋０．１％放線菌酮＋０．２％硫酸新霉素的方法測定。

１．２．３番茄青枯病防治效果測定番茄移栽后，每天觀察植株發病情況。發病率及病情指數調查參照方中達《植病研究方法》的相關內容［９］。番茄青枯病按發病嚴重程度分為５級，０級為葉片無癥狀；１級為植株１／４以下的葉片表現萎蔫癥狀；２級為植株１／４~１／２葉片表現萎蔫癥狀；３級為植株１／２以上葉片表現萎蔫癥狀；４級為全株萎蔫死亡。病情指數＝［∑（病級株數×代表數值）／（株數總和×發病最重級的代表數值）］×１００。防病效果（％）＝［（對照病情指數－處理病情指數）／對照病情指數］×１００。

１．２．４番茄生物量指標的測定番茄株高采用卷尺測量從莖基部至最頂端的長度；植株鮮重采用直接稱量法；干重采用烘干法，先１０５℃殺青０．５ｈ，然后６５℃烘干至恒重。

１．２．５土壤微生物功能多樣性分析采用ＢＩＯＬＯＧ －ＥＣＯ微平板研究接種微生物菌劑Ｘ－４對土壤微生物多樣性的影響。分別取移栽０、６、１２、１８、２４、３０、３６ ｄ的番茄盆栽土壤進行分析，具體方法參照文獻［１０］。ＡＷＣＤ（Ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）計算方法如下：ＡＷＣＤ＝［∑（Ｃ－Ｒ）］／３１，其中Ｃ指各反應孔在５９０ｎｍ下測定的吸光值（ＯＤ５９０nm），Ｒ是對照孔的吸光值。

１．２．６數據分析數據采用ＳＡＳ ９．０進行統計分析。

２結果與分析

２．１菌株Ｘ－４在土壤中的定殖動態

接種微生物菌劑后，分別于不同時間測定盆栽土壤中Ｘ－４的數量（圖１）。從圖１可以看出，不同接種水平時土壤中Ｘ－４基本呈現相似的變化規律，表現為先升后降，１２ ｄ時達到比較高的定殖水平，數量為１．６９×１０７～１．９０×１０７ＣＦＵ／（ｇ土），并且一直維持比較高的定殖水平至２７ ｄ左右，菌株Ｘ－４在土壤中的定殖高峰可維持１０～１５ ｄ。

２．２接種Ｘ－４對土壤中青枯菌數量的影響

分別在接種Ｘ－４后０、６、１２、１８、２４、３０、３６ ｄ測定土壤中的青枯菌數量（圖２）。從圖２可以看到，青枯菌數量在接種后的幾天時間里有短暫的增加，這與番茄苗移栽后引起根際分泌物增加和接種菌劑中含有一定的營養物質有關，但隨后很快下降。對照土壤中青枯菌數量基本維持在一個比較穩定的水平，而Ｘ－４處理的土壤病菌數量則呈現下降趨勢，到３０ ｄ時降到最低水平，T1、T2處理分別比對照降低８１．１％和９０．１％，至３６ ｄ后青枯菌數量略有回升，這與此時土壤中拮抗菌數量下降、抑制力減弱有關。從圖２還可看出，接種量大的處理Ｔ２青枯菌數量下降趨勢更明顯，方差分析結果表明，自第１２天起，接種Ｘ－４的處理其青枯菌數量與對照相比差異均達顯著水平，接種拮抗菌能有效降低盆栽土壤中病原菌數量。

２．３接種Ｘ－４對番茄青枯病的防治效果

從番茄栽培開始至５５ ｄ后收獲，連續調查其發病率和病情指數，分別統計了３５、４５、５５ ｄ的相關數據（表２），從表２中結果可以看到，３５ ｄ時接種清水的處理已經有青枯病發生，而接種拮抗菌Ｘ－４的處理其發生青枯病時間要晚于對照；從調查結果看，接種Ｘ－４的抑病效果呈降低趨勢，到５５ ｄ時Ｔ１和Ｔ２的抑病效果分別為３０．６％和５７．２％；從病情指數看，與對照相比，接種Ｘ－４的處理４５、５５ ｄ時均達到顯著水平。從表２結果還可看到， 加大接種量有利于提高防病效果，Ｔ２在４５ ｄ和５５ ｄ的防效分別為８３．３％和５７．２％，明顯高于Ｔ１，可以得出，接種量是影響防病效果的因素之一。結合圖１結果，接種２４ ｄ枯草芽孢桿菌Ｘ－４定殖達到高峰，說明此階段是抑病力最強點，隨著時間的延長，抑病效果會隨Ｘ－４數量減少而逐漸減弱，接種４５ ｄ的防病效果要好于５５ ｄ就證明了這一點。

２．４接種Ｘ－４對番茄生物量的影響

番茄栽培５５ ｄ后收獲，分別調查其株高、鮮重、干重等生物量指標。結果發現，接種枯草芽孢桿菌Ｘ－４可以促進植株生長，表現為株高、單株鮮重、總鮮重增加，同時單株干重也有一定程度的增加，總干重增加較多，Ｔ１、Ｔ２分別增加１６．００％和１１．５５％。此外，接種拮抗菌Ｘ－４還能促進結果，接種處理其單株結果數量均高于對照，每株分別多１．９和１．５個。試驗結果表明，菌株Ｘ－４不僅具有對病菌的抑制作用，而且還具有較好的促生效果，其防效明顯與抑菌及促生效果有關。

２．５接種Ｘ－４對土壤微生物功能多樣性的影響

圖３顯示，接種微生物菌劑Ｘ－４后不同處理的土壤ＡＷＣＤ除在１２ ｄ比對照有明顯的提升和２４ ｄ時Ｔ２亦高于對照外，其余時段ＣＫ與Ｔ１、Ｔ２差異不大，基本呈現相似的變化規律，即先下降、18 d左右時（T2）、２４ ｄ左右時（CK、T1）又開始回升，說明接種Ｘ－４對土壤微生物多樣性無不利影響。至于試驗中不同時間的ＡＷＣＤ表現出先降后升的變化規律，可能與當時試驗的環境條件變化有關系，試驗過程中經歷了一個低溫期，而低溫影響土壤微生物的代謝活性，導致ＡＷＣＤ下降，研究表明，在一定范圍內土壤濕度、溫度等是影響土壤微生物活性和多樣性的重要因素［１１，１２］。

３討論

研究微生物在土壤及作物體內的定殖是揭示其發揮促生或抗病作用的基礎，以前曾有過許多相關研究［１３－１５］，這些文獻重點研究了引入微生物在作物根際和體內的定殖效果和規律、影響定殖的因素以及對植物病害的防效等方面，而研究接種拮抗菌與致病菌在土壤中的動態變化關系方面鮮有報道。研究通過ｇｆｐ標記方法跟蹤了枯草芽孢桿菌Ｘ－４在土壤中的動態變化，并測定了病菌數量相應變化數據，顯示了兩者此消彼長的密切聯系及對番茄青枯病的影響，研究結果表明，接種Ｘ－４與病菌數量、病情指數間確實有內在聯系。

３．１菌株Ｘ－４與病菌的消長關系對青枯病的影響

研究結果顯示，在番茄生長期中枯草芽孢桿菌Ｘ－４的定殖曲線為一非對稱拋物線，前期緩慢升高，２４ ｄ達到高峰后急劇下降，且降幅很大，６ ｄ后跌至低點，中期以２４ ｄ為最高點，由于下降快，下降后維持在較高水平的時間估計為３ ｄ，故中期菌量高峰維持時間為１２～２７ ｄ左右，菌株Ｘ－４的這一動態變化與病菌呈現明顯的此消彼長關系。由于受到高量Ｘ－４的壓制，Ｔ１、Ｔ２處理土壤青枯菌數量在１２～30 ｄ時段內處于低水平且呈現下降的趨勢，而ＣＫ由于沒有Ｘ－４的壓制作用，病菌數量處于高水平并且還有上升趨勢。這期間高數量病菌開始侵染番茄植株，３５ ｄ開始表現發病癥狀，而Ｔ１、Ｔ２處理由于病菌數量低，尚無發病，直至４５ ｄ時才表現出較輕的發病癥狀。這表明Ｘ－４與病菌的強弱消長對番茄青枯病發生有密切關系，通過施肥調控拮抗菌Ｘ－４與病菌的消長對青枯病防治有重要影響。

３．２菌株Ｘ－４動態曲線與施肥防病技術策略

土壤中枯草芽孢桿菌Ｘ－４與青枯菌的動態變化顯示二者存在密切的消長關系，并影響青枯病發生的遲早與輕重。拮抗菌Ｘ－４定殖高峰維持的時間長有利于防病。菌株Ｘ－４的動態變化曲線對于如何制定施肥防病的技術策略有重要參考價值。Ｔ１、Ｔ２處理Ｘ－４數量在達到高峰后迅速下降，對病菌的抑制隨之減弱，因而３０ ｄ后病菌數量回升，番茄感染后于４５ ｄ時表現出癥狀。如果能夠在番茄生長期將Ｘ－４數量維持在較高水平和較長時期，從而保持對病菌的有效抑制力，將有助于進一步推遲發病及減輕病情指數，甚至不發病。試驗中Ｔ１、Ｔ２處理拮抗菌Ｘ－４與病菌消長變化關系對施用策略很有啟發，研究顯示，Ｔ１、Ｔ２處理中Ｘ－４的變化曲線大致一樣，接種量高的處理Ｔ２峰值雖然高于Ｔ１，但同樣急劇下降，在６ ｄ內降至低點，與Ｔ１一樣，這說明大幅增加菌劑用量，對延長其高峰期或減緩其衰減幅度作用甚少，宜分次施肥。試驗表明，拮抗菌Ｘ－４緩慢上升期為１２ ｄ，經過１２ ｄ后才能上升到高峰值，因此需要在Ｘ－４菌量下降至低水平（臨界水平）前１２ ｄ左右再次施用，可維持長時間的定殖高峰，如在２０ ｄ左右施第二次，則有可能在３０ ｄ時形成第二個拋物線增殖峰，而保持對病菌的有效壓制，這樣更有利于防病。譚兆贊等［１６］研究也表明采用分兩次接種處理的堆肥比一次接種防病效果好。

３．３菌株Ｘ－４防病效果的綜合分析

菌株Ｘ－４的防病效果除了對青枯菌的壓制作用外，還與其促生作用有關。試驗表明，接種Ｘ－４對番茄有一定的促進生長效果，其株高、鮮重、干重等生物量指標均優于對照，Ｘ－４定殖的防病效果是抑制病菌與促生長兩方面作用的總和。提高土壤微生物多樣性有利于防治番茄青枯?。郏保叮?，平均每孔顏色變化值（ＡＷＣＤ）是反映土壤中微生物功能多樣性的一個重要指標［１７］，其大小與微生物功能多樣性密切相關，ＡＷＣＤ高有利于維持土壤微生物多樣性水平因而有利于防病。試驗表明，Ｘ－４定殖對土壤微生物ＡＷＣＤ沒有不利影響，而且在某一時段還略有提升。因此，從抑制病菌、促進番茄生長和土壤微生物多樣性方面來分析，菌株Ｘ－４都有作用，其防病效果是這幾個因素的綜合反映。

參考文獻：

［１］ ＶＥＳＳＥＹ Ｊ Ｋ． Ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｓ ｂｉｏ－ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ， ２００３，２５５：５７１－５８６．

［２］ 李俊，沈德龍，姜昕． 我國微生物肥料行業的現狀與發展對策［Ｊ］． 農業質量與標準， ２００３（３）：２７－２９．

［３］ 夏光利，畢軍，張萍，等． 新型生物有機肥（ＮＡＥＦ）對番茄生長及土壤活性質量效應研究［Ｊ］． 土壤通報，２００７，３８（３）：５１９－５２２．

［４］ 譚兆贊，林捷，劉可星，等． 復合微生物菌劑對番茄青枯病和土壤微生物多樣性的影響［Ｊ］．華南農業大學學報，２００７，２８（１）：４５－４９．

［５］ 蔡燕飛，廖宗文，章家恩，等． 生態有機肥對番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響［Ｊ］．應用生態學報，２００３，１４（３）：３４９－３５３．

［６］ ＦＬＩＥＢＢＡＣＨＡ Ａ， ＥＹＨＯＲＮ Ｆ， ＭＡＤＥＲ Ｐ． “ＤＯＫ” ｌｏｎｇ-ｔｅｒｍ ｆａｒｍｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｉａｌ： ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｍａｓｓ， ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ［Ａ］． ＲＥＥＳ Ｒ Ｍ， ＣＡＭＰＥＬＬ Ｂ Ｃ． Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍａｔｔｅｒ［Ｃ］． Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ： ＣＡＢＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２００１．３６３－３６９．

［７］ 郭堅華，龔龍英，祈紅英，等． 三個拮抗菌株對辣椒青枯病的作用機制［Ｊ］． 中國生物防治， ２００３，１９（１）：６－１０．

［８］ ＫＥＬＭＡＮ Ａ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｔｏ ｃｏｌｏｎｙ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｎ ａ ｔｅｒｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９５４，６４：２９３－２９５．

［９］ 方中達． 植病研究方法［Ｍ］．第三版．北京： 中國農業出版社，１９９８．

［１０］ 姚槐應，黃昌勇． 土壤微生物生態學及其實驗技術［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００６．

［１１］ 肖輝林，鄭習?。?土壤變暖對土壤微生物活性的影響［Ｊ］． 土壤與環境，２００１，１０（２）：１３８－１４２．

［１２］ ＳＣＨＵＴＴＥＲ Ｍ Ｅ， ＳＡＮＤＥＮＯ Ｊ Ｍ， ＤＩＣＫ Ｒ Ｐ． Ｓｅａｓｏｎａｌ， ｓｏｉｌ ｔｙｐｅ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｉｌｓ，２００１，３４：３９７－４１０．

［１３］ 楊合同，陳凱，李紀順，等． 重組巨大芽孢桿菌在小麥根際的定殖及對植物真菌病害的防治效果［Ｊ］．山東科學，２００３，１６（３）：１２－１７．

［１４］ ＨＥＩＪＮＥＮ Ｃ Ｅ． Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ ａｍｅｎｄｅｄ ｓｏｉｌ［Ｄ］． Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ， tｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ： Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， １９９２．

［１５］ ＫING Ｅ Ｂ， ＰARKE Ｊ Ｌ． Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏ－ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＡＭＭＤＲＩ ｏｎ ｆｏｕｒ ｐｅａ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］． Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９６， ２８： ３０７－３１２．

［１６］ 譚兆贊，徐廣美，劉可星，等． 不同堆肥對番茄青枯病的防病效果及土壤微生物群落功能多樣性的影響［Ｊ］． 華南農業大學學報，２００９，３０（２）：１０－１４．

［１７］ ＹＡＮ Ｆ， ＭＣＢＲＡＴＮＥＹ Ａ Ｂ， ＣＯＰＥＬＡＮＤ Ｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ： Ａ ｈｏｒｉｚｏｎｓ ｏｆ ｖｅｒｔｉｓｏｌｓ ｉｎ ＮＷ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ［Ｊ］． Ｇｅｏｄｅｒｍａ， ２０００， ９６：３２１－３４３．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文