貴州省稻瘟病菌遺傳譜系與生理小種關系

摘要：為厘清貴州省稻瘟病菌主要菌株的遺傳譜系的劃分及遺傳譜系與生理小種的關系，采用基因組重復序列ＰＣＲ技術（ｒｅｐ－ＰＣＲ）對貴州省的稻瘟病菌進行基因組指紋分析，結果顯示從１５４個供試菌株分別擴增到２～１５條ＤＮＡ帶，經ＤＰＳ分析軟件聚類分析，在歐氏距離３．８５遺傳相似水平處，供試菌株分為１２個遺傳譜系。結合傳統的植物病理學研究方法，通過對供試菌株的生理小種類型進行測定，將１５４個菌株分為６個組群２１個小種，其中ＺＢ群占優勢，ＺＢ１、ＺＢ１３為優勢小種。比較按遺傳譜系和生理小種對菌株的分類，可見，菌株遺傳譜系與生理小種間并不存在確定的一一對應關系，同一譜系可由多個不同生理小種菌株組成，而同一生理小種菌株亦可分屬于不同的譜系。

關鍵詞：稻瘟病菌；遺傳譜系；生理小種；貴州省

中圖分類號：Ｓ４３５．１１１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2438-03

Study on Relationship between the Genetic Lineage and Physiologic Races of

Pyricularia oryzae in Guizhou Province

ＪＩＡＮＧ Ｙｕ－ｌａｎ，ＴＡＮ Ｐｉｎｇ，ＸＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｑｉｏｎｇ

（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅｓ ｏｆ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｕｉｚｈｏｕ pｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｐ－ＰＣＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ２ ｔｏ １５ ＤＮＡ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｏｒ １５４ ｓｔｒａｉｎｓ； ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅｄ ｔｏ １２ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ３．８５ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＤＰＳ． Ｔｈｅ １５４ ｓｔａｉｎｓ ｗａｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ ２１ ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｉｅｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎｏ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅｓ． Ｏｎｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｙ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅ ｍａｙ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｎｅａｇｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅ； Ｇｕｉｚｈｏｕ pｒｏｖｉｎｃｅ

由稻瘟菌［有性世代Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍａｌｉｎｖｅｒｎｉａｎａ（Ｃａｔｔ．）Ｍｉｙａｋｅ，無性世代Ｐｙｒｉｃulａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．］引起的稻瘟病，廣泛發生于世界各地稻區，是世界水稻生產中具毀滅性的病害之一［１，２］。防治該病最經濟有效的辦法是選育抗病品種，但目前生產上應用的水稻抗稻瘟病品種的抗性多屬于垂直抗性，往往因稻瘟病菌致病性變異而導致品種抗性喪失，抗性品種的最佳種植年限一般僅能維持２～３年［３］。水稻品種抗病性喪失是寄主與病原物互作的結果，目前已能從基因水平上準確闡述寄主與致病菌之間的關系。自上世紀８０年代末Ｈａｍｅｒ等［４］報道從稻瘟病菌基因組中克隆到一重復的ＤＮＡ序列，將其用于病原菌的ＤＮＡ指紋分析［５］以來，ＤＮＡ指紋分析技術已被用于稻瘟病菌群體遺傳研究［６－８］。研究表明，稻瘟病菌群體的遺傳基礎是由在ＤＮＡ水平上具有高度同源性的菌株組成的組群（Ｇｒｏｕｐ），或稱遺傳譜系（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）構成。開展稻瘟病菌遺傳譜系的研究可使稻瘟病在各個流行地區內的病原菌遺傳變異信息被更準確地掌握，有助于指導開展持久抗稻瘟病品種育種，通過合理利用水稻抗性，延長抗性品種的抗病年限，把水稻稻瘟病抗性育種水平推上一個新臺階。試驗對貴州省內采集的１５４個稻瘟病菌菌株進行了遺傳譜系和生理小種分析，以厘清貴州省稻瘟病菌主要菌株的遺傳譜系的劃分及遺傳譜系與生理小種的關系。

１材料和方法

１．１供試菌株

自貴州各稻區采集水稻稻瘟病發病植株，帶回實驗室用單孢分離方法［９］獲得稻瘟病菌的單孢菌株１５４個，各單孢菌株置于淀粉酵母培養基斜面上培養７～１０ ｄ后，采用液體完全培養基培養各菌株菌絲體。液體完全培養基配方為：Ｓｕｃｒｏｓｅ １０ ｇ；Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ６ ｇ；Ｃａｓｉｎｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｅ ｌｙｓａｔｅ ６ ｇ；Ｖｏｇｅｌ’ＳＮ ４０ ｍＬ，加水定容至１ ０００ ｍＬ并調ｐＨ值至６．８～７．０。

培養菌絲體時，將斜面培養基上菌絲塊轉移到裝有４０～５０ ｍＬ液體完全培養基的容量為１００ ｍＬ的三角瓶中，在搖床上培養（２４ ℃，１００～１２０ ｒ/min） ５～７ ｄ，待菌絲增殖至足夠量時，用真空泵將菌絲體抽濾到濾紙上，然后將菌絲體轉入５ｍＬ的離心管， －２０ ℃冰箱保存。

１．２稻瘟病菌全基因組ＤＮＡ提取

采用ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ法提取稻瘟病菌全基因組ＤＮＡ。具體步驟如下：①菌絲體于冷凍干燥機上干燥２４ ｈ，加液氮研成菌絲粉；取干菌絲粉２０～３０ ｍｇ裝入２ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ離心管，加提取緩沖液５００ μＬ，振搖混勻。緩沖液配比５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ值８．０）、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ。②在上述混合液中，加１０％ ＳＤＳ ５０ μＬ，將離心管橫放，在搖床中輕搖１ ｈ（４０～５０ ｒ/min，３７ ℃）。③加５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液７０ μＬ輕搖，使溶液充分混勻。④加１０％ ＣＴＡＢ溶液（１０％ ＣＴＡＢ溶于０．７ ｍｏｌ/Ｌ ＮａＣｌ中）６５ μＬ，在６５℃下水浴放置１０～２０ ｍｉｎ，其間輕搖數次。⑤加７００ μＬ氯仿、異戊醇混合液（體積比２４∶１），于搖床１５０ ｒ/min搖動５ ｍｉｎ；１０ ０００ ｒ/min離心１２ ｍｉｎ，取上清液裝入新的ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ ｍＬ離心管中。⑥加入４５０ μＬ經預冷的異丙醇，－２０ ℃冷凍１ ｈ以上，１０ ０００ ｒ/min離心１２ ｍｉｎ，收集沉淀。⑦沉淀用７０％乙醇漂洗２次，風干后溶解于２００ μＬ ＴＥ緩沖液［１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ值７．５～８．０），１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］中，此液即為ＤＮＡ樣品。ＤＮＡ樣品放置于－４０ ℃低溫冰箱中保存。

１．３ＰＣＲ擴增

ＰＣＲ引物為稻瘟病菌基因組特異性的一對反向擴增引物Ｐｏｔ２－１（５′－ＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＧＴＴ

Ｔ－３′）和Ｐｏｔ２－２（５′－ＣＣＣＴＣＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＧＴＴＣ－３′），引物堿基序列由國際水稻研究所（ＩＲＲＩ）Ｌｅｕｎｇ Ｈ博士提供，由上海生工生物工程有限公司合成。ＰＣＲ反應體系為２５ μＬ，引物濃度為０．５ ｍｏｌ／Ｌ，１倍緩沖液［１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ值９．２），２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣＬ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１５ ｍｍｏｌ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４］，１８５ μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，２．５ Ｕ Ｔａｇ酶，模板ＤＮＡ ５０ ｎｇ。ＰＣＲ擴增在ＰＴＣ－２００型擴增儀中進行，擴增循環為９５ ℃ ２．５ ｍｉｎ預變性；９４ ℃ １ ｍｉｎ，６２ ℃ １ ｍｉｎ，６５ ℃ ４ ｍｉｎ ４次循環；９４ ℃ ３０ ｓ，６２ ℃ １ ｍｉｎ，６５ ℃ ４ ｍｉｎ ２６次循環；６５ ℃ ５ ｍｉｎ。完畢后４ ℃保存待檢。

１．４檢測與分析

取擴增產物１０ μＬ，加２ μＬ點樣緩沖液（０．２５％溴酚蘭，４０％蔗糖水溶液），混勻，點入０．５％瓊脂糖＋０．７５％ ＳｙｎｅｒｇｅｌＴＭ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）凝膠孔中。０．５×ＴＢＥ緩沖液１２０ Ｖ穩定電壓電泳７ ｈ，０．５ μｇ／ｍＬ的ＥＢ染膠２０ｍｉｎ，凝膠成像系統照相存盤（圖１）。為確定菌株間的遺傳關系，將譜帶的有無轉換為二進制數據（１代表有，０代表無），然后應用唐啟義等［１０］的ＤＰＳ軟件分析法對供試菌株擴增譜帶進行聚類分析。

１．５稻瘟病菌的生理小種測定

按中國稻瘟病菌生理小種統一鑒定標準，應用全國稻瘟病菌生理小種聯合試驗組的７個中國鑒別品種［１１］，測定１５４個供試菌株的致病型。水稻種子經浸種催芽后，播于育苗盤內，于幼苗３～４葉期接種，接種液每毫升中含（２～３）×１０５個稻瘟病菌孢子。

接種后的植株在２６ ℃±１ ℃和高濕條件下保持１６～２０ ｈ，然后移入２７ ℃±１ ℃和高濕的溫室中，７ ｄ后按Ｒ、Ｍ、Ｓ標準進行調查［１２］。

２結果與分析

２．１供試菌株ｒｅｐ－ＰＣＲ擴增結果

應用ＤＰＳ分析軟件［１０］對供試菌株ＰＣＲ擴增譜帶進行聚類分析。結果（圖２）表明，在歐氏距離（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）３．８５遺傳相似水平處，可把１５４個菌株（譜帶２條以上）劃分為１２個遺傳譜系 （遺傳相似組）。在１２個遺傳譜系中，第一、六、五、八為優勢譜系，第一譜系有２５個菌株，第六譜系有２０個菌株，第五譜系有１７個菌株，第八譜系有１６個菌株，分別占總菌株數的１６．２％、１３．０％、１１．０％、１０．４％；第二、四、七、十二、三、十一、九譜系分別有１３、１３、１２、１１、９、８、７個菌株；第十譜系僅有３個菌株（表１）。

２．２稻瘟病菌菌株遺傳譜系與生理小種關系

參試的１５４個稻瘟病菌菌株可分為６群２１個小種，即ＺＢ１、ＺＢ３、ＺＢ５、ＺＢ９、ＺＢ１３、ＺＢ１５、ＺＢ１７、ＺＢ２１、ＺＢ２３、ＺＢ２７、ＺＢ２９、ＺＣ１、ＺＣ５、ＺＣ７、ＺＤ１、ＺＤ３、ＺＤ５、ＺＥ１、ＺＥ３、ＺＦ１和ＺＧ１（表１）。其中ＺＢ群為優勢種群，出現頻率４７．４％。ＺＢ１小種和ＺＢ１３小種為優勢小種，出現頻率分別為１６．９％、１４．９％。

稻瘟病菌菌株遺傳譜系與生理小種間并不存在較嚴格的對應關系。同一遺傳譜系可由多個不同的生理小種菌株組成，如在第一譜系中同時出現生理小種為ＺＢ１、ＺＢ１５、ＺＣ１、ＺＤ１、ＺＦ１、ＺＧ１的菌株；而同一生理小種菌株亦可分屬不同的遺傳譜系，如同屬生理小種ＺＢ１的菌株既出現在第一譜系，又出現在第二、三、四、五等多個遺傳譜系中。

３結論與討論

稻瘟病菌遺傳譜系研究表明，在貴州省采集的１５４個菌株分屬于１２個遺傳譜系，其中第一、六、五、八為優勢譜系。用中國稻瘟病菌生理小種統一鑒別品種可將１５４個參試菌株分為６群２１個小種。分析發現稻瘟病菌菌株遺傳譜系與生理小種間并不存在一一對應關系，同一遺傳譜系可由多個不同的稻瘟病菌生理小種菌株組成，如屬于生理小種為ＺＢ１、ＺＢ１３、ＺＧ１、ＺＦ１、ＺＤ１、ＺＢ３、ＺＢ１５、ＺＣ１、ＺＥ１、ＺＤ５、ＺＢ２１的菌株都存在于第一遺傳譜系中；同一生理小種菌株亦可分屬于幾個不同的遺傳譜系，如生理小種ＺＢ１的菌株既出現在第一譜系，又出現在第二、三、四、五、六等遺傳譜系中。可見，應用全國統一的７個稻瘟病鑒別品種對稻瘟病菌株進行的生理小種的分類，并不能準確地反映出貴州省稻瘟病菌的遺傳特征。分子指紋分析技術有助于在ＤＮＡ水平上反映稻瘟病菌遺傳多樣性的實質，便于更準確地掌握稻瘟病病原菌的遺傳變異信息，利于指導開展水稻持久抗稻瘟病育種工作，并可為具有不同遺傳背景水稻品種在種植中的合理布局提供理論依據。

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