花生DＮA三種不同限制酶切組合的AFLP多態性標記分析

摘要：利用擴增片段長度多態性（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）標記技術，３種不同的酶切組合，其中ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ２４０對引物、ＰｓｔⅠ／ＭｓｅⅠ９６對引物、ＰｓｔⅠ／ＴａｑⅠ９６對引物，對汕油１６２×Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ作圖親本進行分析，統計了不同酶切組合的擴增總帶數、多態性位點及多態性率。多態性位點、多態性率及擴增總帶數都有不同程度的差異，說明嘗試不同的限制酶組合可以揭示出花生品系間更為豐富的遺傳變異。有望開發ＡＦＬＰ分子標記，為花生分子育種打下基礎。

關鍵詞：花生；ＡＦＬＰ；多態性；內切酶

中圖分類號：Ｓ５６５．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2555-03

Ｔｈｅ ＡＦＬＰ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｐｅａｎｕｔ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ

ＤＩＮＧ Ｊｉｎ－ｐｉｎｇ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ４７６０００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌｌｙ ２４０ ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ， ９６ PｓｔⅠ／ ＭｓｅⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ａｎｄ ９６ PｓｔⅠ／ ＴａｑⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｈａｎｙｏｕ１６２×Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ ｐｅａｎｕｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｒｅｎｔａｌ ｌｉｎｅｓ， Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂａｎｄｓ， ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ ｔｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｍａｙ ｂｅ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｐｅａｎｕｔ． Ｉｔ ｉｓ ｊｕｄｉｃｉｏｕｓ ｏｐｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｏ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅａｎｕｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａｎｕｔ；ＡＦＬＰ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ；ｅｎｄｏｎｕｌｅａｓｅ

花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ，２ｎ＝４ｘ＝４０）是我國重要的油料作物和經濟作物，優良品種花生仁粗脂肪含量在５０％左右，其中油酸和亞油酸之和占總脂肪酸的８０％。油酸和亞油酸分別含有一個和兩個不飽和鍵十八碳烯酸，二者之比——油酸亞油酸比值（Ｏ／Ｌ值）是影響花生及其制品耐儲藏性的重要指標。一般花生品種油酸含量為３７％～６７％［１］。花生是一種普通農作物，但其在ＤＮＡ分子水平上卻表現出與其他作物不同的特性。盡管不同類型間和同一類型不同品種間的花生，在農藝性狀如生長開花習性、抗逆性、品質特性等方面存在著廣泛的遺傳變異，但早期用隨機擴增多態性ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）和限制性內切酶片段長度多態性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）等分子鑒定技術檢測到栽培花生ＤＮＡ幾乎沒有或只有很低的多態性［２－４］。基于花生基因組ＤＮＡ的特殊性和相關基礎分子遺傳學研究的不足，目前尚未建立栽培花生的遺傳連鎖圖，與其他主要農作物相比，花生分子標記研究尚處于起步階段。目前在花生上可用的微衛星ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）標記數量仍然很有限，而且不是所有的基因或農藝性狀都可以用ＳＳＲ進行標記，因此，在花生上還需要分離更多其他類型的標記。ＡＦＬＰ由于無需預先知道目標生物的序列信息并且一次可同時檢測多個位點，ＡＦＬＰ和分離群體分組分析（Ｂｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）方法相結合被認為是挖掘緊密的分子標記和構建目標基因區飽和連鎖圖最為有效的方法之一［５－７］。研究利用ＡＦＬＰ標記技術，選用不同的酶切組合尋找親本的差異，為以后利用ＡＦＬＰ和ＢＳＡ相結合的方法尋找與Ｏ／Ｌ值性狀連鎖的ＡＦＬＰ標記奠定了基礎，也為花生分子輔助育種奠定了基礎。

１材料與方法

１．１材料

花生汕油１６２（由廣東省汕頭市農業科學研究所育成），其Ｏ／Ｌ值為１．１２；花生Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ（Ｆ１２５０）是美國弗羅里達大學于１９９７年注冊的高油酸新品種，其油酸含量高達８０．６％，而亞油酸含量僅為２．８％，Ｏ／Ｌ值高達２８．７９。

１．２ＤＮＡ的提取

取花生幼苗的幼嫩葉子，按唐榮華［８］方法稍加改進進行。

１．３ＡＦＬＰ分析

ＡＦＬＰ分析流程參考文獻［８］，３對內切酶組合分別合成２４０、９６、９６對引物（表１），采用６％聚丙烯酰胺凝膠分離分析，常規銀染法染色，按照清晰可辨的原則統計擴增條帶。

２結果與分析

圖１為３種限制性酶組合部分ＡＦＬＰ擴增圖譜。應用３種不同的酶切組合合成的引物對，對親本Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ和汕油１６２ ＤＮＡ進行擴增，不同的酶切組合擴增的結果不同。

ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ共２４０對引物，每對引物擴增出條帶數為１２～８８，總共擴增出的條帶數為１１ ６４０條，其中９０對引物在兩個親本間可以擴增出多態性，每對ＡＦＬＰ引物在兩個親本間擴增出的多態性位點為１～３個，共１７４個多態性位點，多態性率為１．４９％。

ＰｓｔⅠ／ＭｓｅⅠ共９６對引物，每對引物擴增出條帶數為１２～６１，總共擴增出的條帶數為３ ２１０條，其中３４對引物在兩個親本間可以擴增出多態性，每對ＡＦＬＰ引物在兩個親本間擴增出的多態性位點為１～６個，共７６個多態性位點，多態性率為２．３７％。

ＰｓｔⅠ／ＴａｑⅠ共９６對引物，每對引物擴增出條帶數為１０～５６，總共擴增出的條帶數為２ ５３０條，其中２８對引物在兩個親本間可以擴增出多態性，每對ＡＦＬＰ引物在兩個親本間擴增出的多態性位點為１～８個，共６１個多態性位點，多態性率為２．４１％。

３討論

通過試驗獲得了能揭示作圖親本間遺傳差異的不同引物對，不同的酶切組合多態性位點不同，多態性率也有差異，為今后構建圖譜打下了基礎，為今后分子標記的開發提供了一些參考依據。２００４年Ｈｅｒｓｅｌｍａｎ［９］在定位與花生抗蚜性相關的ＡＦＬＰ

標記時曾采用過不同的酶切組合，檢出不同組合間多態性率存在顯著的差異；２００５年徐建芝［１０］研究了兩種酶切組合在親本和Ｆ１代之間多態性比率，發現不同酶切組合間也存在極顯著差異。本文利用ＡＦＬＰ方法在研究花生Ｏ／Ｌ值時，發現不同的限制性酶組合，其親本間多態性位點數，多態性率也存在差異。說明ＡＦＬＰ分析時，嘗試不同的限制性酶可顯著提高ＡＦＬＰ分析的辨別力。至于在花生栽培研究中，更優的限制性酶切組合還需要根據不同的研究目的，采用更多的材料進一步驗證。

參考文獻：

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