小麥條銹病不同抗性材料中分子標記Yr24-2的檢測

摘要：為了研究小麥條銹病的抗性遺傳基礎及分子標記輔助持久抗性新品系選育技術，利用２２個條銹病抗性材料及４個感病材料并以近緣野生材料作為對照，進行抗性基因Ｙｒ２４分子標記的檢測。結果表明，只有３個抗病材料（３、６、１２）擴增出目標帶（１６５ ｂｐ），但擴增條帶都較弱；４個感病材料（２３～２６）里沒有目標條帶出現；野生材料中的擴增結果表明該抗性基因及其分子標記來源于硬粒小麥。

關鍵詞：條銹病；分子標記；Ｙｒ２４

中圖分類號：Ｓ４３５．１２１．４＋２；Ｑ９４３．２文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）12－2553-03

Detection of Molecular Marker Yr24-2 in Stripe Rust Resistance Wheat Cultivars

ＺＨＯＵ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ，ＷＥＩ Ｑｉ－ｃｈａｏ

（Ｋｅｙ Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ Ｏｐｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｎ Ｃｒｏｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｉｎ Ｈｅｎａｎ／Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｉｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ， ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ Ｙｒ２４ ｗas ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ２２ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ cultivars， ４ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ cultivars， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄ（１６５ｂｐ） ｗａｓ ｏｎｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ （３，６，１２）； ｂｕｔ ｔｈｅ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｗｅａｋ． Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ４ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈａｒｄ ｗｈｅａｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｔｒｉｐ ｒｕｓｔ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ； Ｙｒ２４

小麥條銹病是小麥銹病的一種，是我國小麥生產上分布廣、傳播快、危害面積很大的重要病害，流行年份給小麥生產造成嚴重危害甚至毀滅性打擊［１］。小麥條銹病的大流行往往是由于新生理小種的出現，導致小麥品種抗性喪失。通過聚合育種將不同抗源的抗性基因聚合至一個個體培育出抗性更持久的新品種是長久防治小麥條銹病的根本措施。應用分子標記技術對抗病基因進行跟蹤，實施分子標記輔助選擇，可以快速有效地進行抗源累加，把多個抗病基因聚合在同一個品種中，從而大大提高育種效率［２］。研究通過對小麥條銹病的抗性基因分子標記Ｙｒ２４－２的篩選來考察一批抗性材料的抗性基因組成，為新品系的抗性遺傳基礎鑒定及持久抗性新品種選育提供理論及技術支撐。

１材料與方法

１．１材料

本研究所用的植物材料見表１、２。

１．２方法

小麥基因組ＤＮＡ的提取方法為ＣＴＡＢ抽提法［３］。

用前人已經報道的抗條銹病基因Ｙｒ２４的分子標記對上述２６個抗病、感病材料進行ＰＣＲ擴增［４，５］，來進行本研究（表３）。采用１５．０ μＬ反應體系：模板ＤＮＡ ３．０ μＬ，上下游引物各０．５ μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ １．５ μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１．４ μＬ，Ｔａｑ酶（２．５ Ｕ／μＬ） ０．４ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ７．７ μＬ。ＰＣＲ循環參數：９４ ℃、５ ｍｉｎ；９４ ℃、１ ｍｉｎ，５３ ℃、１ ｍｉｎ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃、１０ ｍｉｎ；４ ℃，保存。采用２％瓊脂糖凝膠進行電泳，緩沖液為１×ＴＡＥ；電泳結果用凝膠成像系統進行拍照，保存。

２結果分析

２．１Ｙｒ２４－２在２６個材料中的擴增結果

試驗結果表明（圖１、圖２），擴增出目標條帶（１６５ｂｐ）的材料只有３號（ＢＮ５）、６號（０２Ｇ１３）和１２號（陜２５３－３），且這３個材料均為抗病材料，在２３～２６這４個感病材料里沒有目標條帶出現。

３個抗病材料擴增出來的目標條帶都較弱，只有１２號（陜２５３－３）能夠看出相對清晰的目標條帶，說明這幾個材料的基因組ＤＮＡ中與該標記引物序列配對區之間可能存在序列變異，導致引物結合力不夠，擴增條帶較弱；除１１號（抗白３號）、１４號（內２８３６）、１５號（ＴＭＡ３５）材料外還有大量非特異性擴增條帶，分別在５００～６００ ｂｐ和２００ ｂｐ，說明該分子標記引物序列可能位于一個基因家族上，導致擴增出許多非特異的非目標條帶，或者是由于ＤＮＡ本身的多態性所致；另外，擴增結果顯示，除１５號（ＴＭＡ３５）、１６號（內鄉１８８）材料外，其他材料都沒有出現引物二聚體，說明該引物上下游序列間或引物自身沒有或有極短互補配對區，引物質量較好。

２．２Ｙｒ２４－２在野生近緣材料中的擴增結果

Ｙｒ２４基因來源于硬粒小麥，為了進一步驗證該基因分子標記Ｙｒ２４－２的正確性，以包含硬粒小麥在內的１２種野生近緣材料基因組ＤＮＡ為模板，進行了ＰＣＲ擴增。由圖３可以看出，Ｊ１（四倍體硬粒）、Ｊ２（意大利硬粒）、Ｊ４（硬粒小麥）、Ｊ６（野牛）、Ｊ９（斯卑爾托）、Ｊ１２（波斯小麥ＰＳＳ）中均出現了１６５ ｂｐ左右的目標條帶。從擴增結果來看，幾種硬粒小麥（Ｊ１、Ｊ２、Ｊ４）都能擴增出目標條帶，說明該抗性基因及其分子標記來源正確。該標記在Ｊ６、Ｊ９、Ｊ１２也能擴增出目標條帶，暗示了這３種近緣材料中可能也含有Ｙｒ２４基因，至少含有與該標記引物序列配對區相似的ＤＮＡ序列，這為在野生近緣材料中尋找新抗源提供了分子學證據。

３討論

條銹病抗性基因Ｙｒ２４對目前我國多數生理小種均表現高抗，說明含有Ｙｒ２４基因的品種在我國仍是有效抗源。因此，眾多農業科技工作者對該基因進行了深入研究，開發了其分子標記［６－８］。為了探索該標記的直接應用效果，進行了該研究。研究結果表明，條銹病抗性基因標記Ｙｒ２４－２在２２個抗性材料中，只有３、６、１２號擴增出目標條帶，這暗示其余的抗病材料中含有其他抗性基因；在４種感病材料中沒有目標條帶被擴增出來，在該抗性基因的來源材料——硬粒小麥中能擴增出目標條帶，說明該抗性標記的特異性還是比較高的，但是擴增條帶較弱，應進一步優化擴增條件，增加擴增條帶特異性，降低非特異性擴增帶，或者將擴增帶回收，連接至載體，再進行轉化測序，根據所得序列設計新的較長的特異引物，來增加擴增的特異性，方能作為條銹病抗性基因標記應用于分子標記輔助育種的研究［９，１０］。另外，研究中我們看到在另外３種野生材料中同樣檢測到與目標條帶一致的條帶，當然，我們無法肯定這些條帶就真的是抗性基因標記，也許這些材料中只是含有相似的ＤＮＡ序列，但這為育種者在野生近緣材料中尋找新抗源基因提供了理論參考，也為抗性持久型新品種培育打下了基礎。

參考文獻：

［１］ 張金霞，鈕力亞． 小麥條銹病研究進展［Ｊ］．天津農業科學，２００８， １４（４）：４９－５２．

［２］ 楊濤，關天舒，潘榮光，等． ＤＮＡ分子標記技術在作物單基因抗逆性育種中的應用［Ｊ］． 遼寧農業科學，２００３（３）：１８－２．

［３］ 黃萱，高麗美，張永彥，等． 一種優化的植物總ＤＮＡ提取方

法［Ｊ］． 西北植物學報，２００４，２４（６）：１１０３－１１０６．

［４］ 劉亞萍． 小麥抗條銹病近等基因系的抗條銹性分析及Ｙｒ２４的ＳＳＲ標記［D］． 咸陽：西北農林科技大學，２００５．

［５］ 劉亞萍． 小麥抗條銹病基因Ｙｒ２４的ＳＳＲ標記［Ｊ］． 植物病理學報，２００５，３５（５）：４７８－４８０．

［６］ ＭＣＩＮＴＯＳＨ Ｒ Ａ，ＬＡＧＵＤＡＨ Ｅ Ｓ． Ｇｅｎｅ Ｙｒ２４ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄ，２０００，１１９（1）：８１－８３．

［７］ ＡＬＩ Ｍ，ＪＩ Ｗ Ｑ，ＨＵ Ｙ Ｇ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ f．sp． ｔｒｉｔｉｃｉ） ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ ｌｉｎｅ Ｎ９５１７５［Ｊ］． Ｐａｋ Ｊ Ｂｏｔ， ２０１０， ４２（１）：３８３－３９０．

［８］ ＡＬＬＡＮ Ｒ Ｅ，ＰＵＲＤＹ Ｌ Ｈ． Ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ，１９６７，５１：１０４１－１０４３．

［９］ 李根橋． 川麥４２抗條銹病基因ＹｒＣＨ４２的定位及其與Ｙｒ２４和Ｙｒ２６的等位性檢測［Ｄ］． 烏魯木齊：新疆農業大學，２００６．

［１０］ 董淑靜，許為鋼． 小麥條銹病抗性基因研究進展及分子標記輔助聚合育種［Ｊ］． 中國農學通報，２００９，２５（１３）：１９０－１９６．

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