利用C基因組DＮA和C0t-1 DＮA對藥用野生稻\\大穎野生稻基因組的比較分析

摘要：采用藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ及Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ為探針，分別對藥用野生稻（ＣＣ）自身和大穎野生稻（ＣＣＤＤ）體細胞染色體進行了基因組原位雜交（GISH）和熒光原位雜交（ＦＩＳＨ）分析。利用Ｃ基因組DNA探針進行分析顯示，藥用野生稻２４條染色體都被雜交信號覆蓋；而在大穎野生稻中可區分為２４條ＣＣ型染色體（雜交信號較強）和２４條ＤＤ型染色體（雜交信號較弱）。以Ｃ基因組Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ探針進行分析顯示，在藥用野生稻染色體的端粒、著絲粒、近著絲粒區域有很強的雜交信號，而大穎野生稻中也有２４條染色體在這些區域紅色雜交信號較強，另２４條染色體的雜交信號很弱。表明利用Ｃ基因組ＤＮＡ和Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ為探針的GISH和ＦＩＳＨ技術，都能很好地將大穎野生稻Ｃ、Ｄ染色體組區分開，Ｃ和Ｄ基因組親緣關系較遠，二者具有不同起源。與藥用野生稻Ｃ基因組相比，大穎野生稻Ｃ基因組出現了一些分化。這些都為研究大穎野生稻Ｃ和Ｄ染色體組起源，探討異源四倍體進化機制奠定了基礎。

關鍵詞：藥用野生稻；大穎野生稻；Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ；熒光原位雜交；基因組原位雜交；異源四倍體

中圖分類號：Q813.4文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2548-03

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Aｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ａｎｄ Ｏｒｙｚａ ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ ｗｉｔｈ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ Ｃ0 ｔ－１ ＤＮＡ Pｒｏｂｅｓ

ＤＵＡＮ Ｆｅｎｇ－ｓｅｎ，ＬＩＵ Ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙａｎ，ＱＩＮ Ｒｕｉ，ＬＩ Ｇａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｒｅａ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ （ＣＣ） ａｎｄ Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ （ＣＣＤＤ） ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ GISH ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｎ ｔｈｅ GＩＳＨ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ｐｒｏｂｅ， ２４ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ｗｅｒｅ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｃｏｖｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ； ｗｈｉｌｅ ４８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ： ２４ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｍｏｓｔ ｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｒｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ２４ Ｄ－ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｅｓｓ ａｎｄ ｗｅａｋ ｒｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ＦＩＳＨ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ ｆｏｒ ｐｒｏｂｅ， ａｌｌ Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ’ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ， ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ and ｎｅａｒ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｗｅｒｅ ｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ； ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ａｒｅａ ｏｎ ２４ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ ｗｅｒｅ ｍｏｄｅｓｔｌｙ ｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｒｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ２４ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｈａｄ ｌｅｓｓ ｒｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ Ｄ－ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｃ ａｎｄ Ｄ ｇｅｎｏｍｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ｅａｓｉｌｙ ｂｙ ＦＩＳＨ ｗｉｔｈ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ ｆｏｒ ｐｒｏｂｅｓ， ｔｈｅ Ｃ ａｎｄ Ｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｃ－ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ， ｍａｎｙ ｃｈａｎｇｅ ｗｏｕｌｄ ｈａｄ ｔａｋｅｎ ｐｌａｃｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｃ－ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ． Ａｌｌ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｍｅｎａ ｌａｉｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ ａｎｄ Ｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｏｔｅｔｒｏｐｌｏｉｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： O. officinalis； Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ； Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ； FISH； GＩＳＨ

稻屬（Ｏｒｙｚａ Ｌ．）是禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物中最重要的屬之一。它由兩個栽培種和２０多個野生種組成，廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區［１－３］。野生稻具有極其豐富的遺傳多樣性，具有栽培稻所不具備的優良性狀，目前已從野生稻中發掘出了抗病、抗蟲、耐冷、耐熱、細胞質雄性不育及其他許多抗性強、抗譜廣、抗性穩定的優異基因［４］。Ｖａｕｇｈａｎ等［５］把稻屬分成４ 個復合體， 即栽培稻復合體（Ｏ． ｓａｔｉｖａ ｃｏｍｐｌｅｘ）、藥用野生稻復合體（Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）、馬來野生稻復合體（Ｏ． ｒｉｄｌｅｙｉ ｃｏｍｐｌｅｘ）、疣粒野生稻復合體（Ｏ． ｍｅｙｅｒｉａｎａ ｃｏｍｐｌｅｘ），其中， 藥用野生稻復合體有１０種，涵蓋了ＢＢ、ＣＣ、ＥＥ、ＢＢＣＣ和ＣＣＤＤ共５ 種類型染色體組。Ｃ基因組是藥用野生稻復合體的最基本的基因組成分。在藥用野生稻復合體中，藥用野生稻（Ｏ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ， ＣＣ）、寬葉野生稻（Ｏ． ｌａｔｉｆｏｌｉａ， ＣＣＤＤ）、高稈野生稻（Ｏ． ａｌｔａ，ＣＣＤＤ）、大穎野生稻（Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ，ＣＣＤＤ）和斑點野生稻（Ｏ． ｐｕｎｃｔａｔａ，ＢＢＣＣ）都具有ＣＣ染色體組。因此， 弄清這些種間的遺傳關系， 將有助于更好地保護和利用野生稻中的遺傳資源［４，６］。

基因組原位雜交（Ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＧＩＳＨ）是基于ＦＩＳＨ發展起來的一種原位雜交技術，它能快速、有效地鑒定基因組結構和各基因組之間的親緣關系，因此常被用來鑒別雜交后代基因組的結構和組成［６］。Ｆｕｋｕｉ等［７］利用藥用野生稻總ＤＮＡ作為探針， 分別對小粒野生稻（Ｏ． ｍｉｎｕｔａ）和寬葉野生稻染色體進行基因組原位雜交， 把這兩個野生種鑒定為ＢＢＣＣ和ＣＣＤＤ染色體組。劉鳳麟等［８］利用藥用野生稻ＣＣ基因組總ＤＮＡ為探針，對高稈野生稻、寬葉野生稻中期染色體進行基因組原位雜交，并結合不同的洗脫嚴謹度可以把ＣＣＤＤ基因組中的Ｃ、Ｄ基因組區分開。所以利用基因組原位雜交技術能快速有效地鑒定異源多倍體基因組成分，為分析不同基因組的相互關系，探討異源多倍體基因組的進化機制提供了強有力的工具。Ｃ0ｔ－１

ＤＮＡ主要為中度和高度重復序列，包含衛星ＤＮＡ，微衛星ＤＮＡ，核糖體ＤＮＡ以及端粒、著絲粒重復序列等重復序列， 決定著染色體的重要結構和特征。因此在物種間具有一定的保守性。此外，Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ受到的選擇壓力小，比單或低拷貝序列變異速度快，可以體現一些種內的變化，對于研究屬內的種間親緣關系具有一定的優勢［６］。藍偉偵等［６］利用栽培稻的Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ作探針，對藥用野生稻和疣粒野生稻基因組進行比較分析，發現二者基因組中高度重復序列具有很強的同源性和保守性［９］。同時，他們還利用藥用野生稻Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ為探針，對栽培稻（ＡＡ）×藥用野生稻（ＣＣ）雜交后代Ｆ１（ＡＣ）進行ＦＩＳＨ分析，發現Ａ基因組和Ｃ基因組中高度重復序列（Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ）具有變異性的一面。

大穎野生稻、寬葉野生稻和高稈野生稻都是分布于拉丁美洲的異源四倍體多年生物種，且均含有ＣＣＤＤ染色體組。它們在地理分布上基本重疊，在形態上也極為相似。Ｊｅｎａ等［１０］根據細胞學、同工酶以及近年來的分子證據認為，歸并這３種或將其作為種內不同等級處理更為合適。近些年來主要對寬葉野生稻和高稈野生稻研究頗多。藍偉偵等［６］的研究認為高稈野生稻中ＤＤ基因組和ＣＣ基因組的親緣關系比寬葉野生稻中ＤＤ基因組和ＣＣ基因組的親緣關系近。劉鳳麟等［８］進一步發現寬葉野生稻中的ＣＣ基因組比高稈野生稻和藥用野生稻中的ＣＣ基因組更加原始。相比之下，對大穎野生稻的ＣＣＤＤ基因組研究較少。由于大穎野生稻、寬葉野生稻和高稈野生稻同屬ＣＣＤＤ基因組，起源于母本為ＣＣ基因組單次雜交事件，進化機制可能相似［６］。因此研究利用藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ和Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ為探針分別對大穎野生稻體細胞進行GISH和FISH，并以藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ和Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ為探針分別對藥用野生稻自身體細胞GISH和FISH為對照，研究大穎野生稻Ｃ、Ｄ基因組的親緣關系，探討大穎野生稻可能的進化機制。

１材料與方法

１．１材料及其染色體制片

供試材料藥用野生稻（Ｏ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｗａｌｌ）稻株１５８９由廣東省國家野生稻圃提供，大穎野生稻（Ｏ． ｇｒａｎｄｉｇｌｕｍｉｓ）由華中農業大學邢勇忠教授提供。染色體制片分別參照Ｙａｎ等［１１］和Ｒｅｎ等［１２］的方法。

１．２Ｃ基因組ＤＮＡ與Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ制備

ＣＴＡＢ法提取藥用野生稻基因組總ＤＮＡ，參照Ｒｅｎ等［１２］方法稍作修改。Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ制備參照Ｄｏｙｌｅ等［１３］方法并稍作修改，即將藥用野生稻基因組ＤＮＡ在０．１４ ＭＰａ高壓下滅菌３ ｍｉｎ，使其打斷成８００～

１ ５００ ｂｐ長的片段，根據Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ 動力學公式

Ｃ0ｔ－１（ｍｏｌ／Ｌ）＝Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）×Ｔｓ計算Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ完全復性所需的時間；Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ完全復性后，用Ｓ１核酸酶［（２ Ｕ／（μｇＤＮＡ），Ｐｒｏｍｅｇａ］于３７ ℃酶解１ ｈ，然后用平衡酚抽提，無水乙醇沉淀過夜，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，７０％的乙醇洗滌，最后用ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ溶解得到所需Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ。

１．３探針標記

ｇＤＮＡ和Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ采用Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）標記。５０ μＬ反應體系中含有ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｂｉｏｔｉｎ－１１－ｄＴＵＰ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮＡ聚合酶Ｉ、２～３ μＬ基因組ＤＮＡ，１５℃下標記反應３．５ ｈ 后，６０ ℃水浴１０ ｍｉｎ終止反應，用抗生物素蛋白的堿性磷酸酶（ＡＰ，Ａｌａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）的點印記法檢測標記效果。

１．４原位雜交及檢測

基因組原位雜交（Ｇｅｎｉｍｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＧＩＳＨ） 和FISH方法參閱Ｊｉａｎｇ等［14］的ＦＩＳＨ程序稍加修改。染色體制片于６０ ℃烤片１ ｈ；ＲＮａｓｅ Ａ／２×ＳＳＣ（１０ μｇ／ｍＬ）３７ ℃處理１ ｈ，２×ＳＳＣ室溫漂洗１０ ｍｉｎ， 胃蛋白酶（Ｇｅｎｖｉｅｗ）／１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ（５ μｇ／ｍＬ）處理１５ ｍｉｎ，２×ＳＳＣ室溫漂洗１０ ｍｉｎ，甲醛／１×ＰＢＳ室溫固定１０ ｍｉｎ，７０％甲酰胺７０℃變性３．５~５.0 ｍｉｎ，－２０℃ ７０％、９５％和１００％乙醇各脫水５ ｍｉｎ， 室溫晾干；每張片子上雜交液含有８０ ｎｇ 標記的探針ＤＮＡ， ５０％去離子甲酰胺（Ｓｉｇｍａ），８％的硫酸葡聚糖（Ａｍｒｅｓｃｏ），２×ＳＳＣ，０．５％ ＳＤＳ，０．５ μｇ鮭魚精ＤＮＡ（ＤＮＡ Ｓａｌｍｏｎ， Ｓｉｇｍａ），３７ ℃雜交過夜。雜交信號的熒光檢測：４２ ℃ ２０％甲酰胺，２×ＳＳＣ，０．２×ＳＳＣ洗脫，室溫０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（Ｓｉｇｍａ）處理５ ｍｉｎ，室溫１×ＰＢＳ洗脫并涼干片子；每張片子加入Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｃｙ３（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），３７℃溫育１ ｈ，１×ＰＢＳ室溫洗滌３次，每次５ ｍｉｎ；１０ μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ （Ｓｉｇｍａ）復染， ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１ 熒光顯微鏡觀察， 用Ｃａｓｅ Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒ Ｅｘｐｏ ２．１．１ 圖像系統控制的Ｃｏｏｌ－１３００ＱＳ ＣＣＤ （ＶＤＳＧｅｒｍａｎｙ）照相系統攝取圖片。運用ＳＰＯＴ ３２軟件對染色體相關數據進行測量，選用ＡｕｔｏＣＡＤ ２００８對大穎野生稻染色體信號模式圖進行繪制。

２結果與分析

２．１Ｃ基因組ＤＮＡ探針對藥用野生稻自身和大穎野生稻的GＩＳＨ分析

藥用野生稻和大穎野生稻分別是含有ＣＣ基因組的二倍體和四倍體物種，而Ｃ基因組是是藥用野生稻復合體中的基本組成成分。以藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ為探針，對藥用野生稻自身和大穎野生稻體細胞染色體進行基因組原位雜交結果見圖１ａ～圖１ｆ。從Ｃ基因組探針對藥用野生稻自身體細胞的雜交圖可以看出，藥用野生稻２４條染色體都被雜交信號覆蓋，信號很強。而在Ｃ基因組探針對大穎野生稻體細胞的雜交信號圖中，所有的４８條染色體都可以檢測到不同程度的雜交信號。通過比較分析，可見其中有２４條染色體上的雜交信號較多較強，應該屬于Ｃ染色體組，另外２４條染色體上的雜交信號較少且較弱，個別染色體只有很少的雜交信號分布，應屬于大穎野生稻的Ｄ染色體組。

２．２Ｃ基因組Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ對藥用野生稻自身和大穎野生稻的ＦＩＳＨ分析

Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ主要是基因組中除去單拷貝序列的中、高度重復序列，在染色體上分布于特定的區域。以藥用野生稻Ｃ基因組的Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ為探針，同時對藥用野生稻自身和大穎野生稻的體細胞染色體進行熒光原位雜交。從藥用野生稻自身的熒光原位雜交圖１ｇ～圖１ｉ中可以看出，藥用野生稻２４條染色體的著絲粒、近著絲粒、端粒區域基本被雜交信號覆蓋，這些區域是基因組Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ主要集中部位，并且同源染色體具有相似的Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ雜交帶型。從大穎野生稻的體細胞雜交信號圖１ｊ～圖１ｌ可以看出，雜交信號同樣主要分布在染色體的著絲粒、近著絲粒、端粒區域，其中也有２４條染色體的這些區域有較強雜交信號覆蓋，不過與藥用野生稻染色體相比，雜交信號的分布不均勻。有的染色體這3個區域都有很強的雜交信號分布，有的染色體只有這３個區域的１個或兩個區域有雜交信號分布，并且雜交信號相對較少，可見大穎野生稻在進化過程中有相當數量的Ｃ基因組發生了變異。而大穎野生稻另２４條染色體著絲粒、近著絲粒、端粒區域有更少雜交信號分布，應該屬于Ｄ染色體組。

２．３大穎野生稻染色體核型分析

進一步分析以Ｃ基因組DNA探針雜交得到的GＩＳＨ分析圖像為基礎，利用ＳＰＯＴ ３２軟件構建大穎野生稻染色體核型分析圖如圖２ａ及其核型模式圖如圖２ｂ。采用常規方法，以染色體長度為依據，對大穎野生稻的２４對染色體進行排序和編號，可以看出其中２號、３號、５號、６號、７號、８號、９號、１３號、１７號、１８號、２１號、２４號染色體的大部分區域被雜交信號覆蓋，屬于Ｃ組染色體，其余１２對染色體上的雜交信號分布較少，信號較弱，主要集中在端粒、著絲粒、近著絲粒區域，屬于Ｄ染色體組。大穎野生稻中的Ｃ和Ｄ染色體組在染色體總長度等特征上沒有特別的區分，所有染色體的相對長度為（２．８６±０．０５）～（５．７７±０．０３），臂比以大于１．５的較多，即多為亞中間著絲粒（表１）。二者的區別在于與藥用野生稻Ｃ染色體組的親緣關系不同，所以Ｃ基因組DNA探針在兩種類型的染色體上的雜交信號強弱和分布區域不同。

３討論

大穎野生稻、寬葉野生稻、高稈野生稻同屬ＣＣＤＤ基因組，據文獻報道它們在形態學上無明顯差異，但基因組水平上有不同程度的差異。劉鳳麟等［８］利用Ｃ基因組ＤＮＡ為探針的GＩＳＨ分析技術，研究了高稈野生稻、寬葉野生稻的Ｃ和Ｄ染色體組，發現寬葉野生稻的１２對Ｃ染色體組被很好地鑒定出來，而高稈野生稻有９對Ｃ染色體組可以被很好地鑒定出來，另外３對Ｃ組染色體雜交信號很少，說明它們與二倍體Ｃ基因組同源性很低。研究以藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ和Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ為探針，對大穎野生稻基因組進行GＩＳＨ和FISH分析，研究大穎野生稻基因組與藥用野生稻基因組，及大穎野生稻基因組中Ｃ和Ｄ染色體組之間的差異，探討大穎野生稻基因組起源和進化機制。研究發現，利用藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ為探針的GＩＳＨ技術，能很明顯地將大穎野生稻Ｃ、Ｄ染色體組區分開，各有１２對染色體，說明大穎野生稻Ｃ基因組與Ｄ基因組親緣關系較遠，具有不同的原始起源，或二者發生分化的時期較早；大穎野生稻Ｃ基因組和二倍體Ｃ基因組親緣關系很近，因而藥用野生稻Ｃ基因組探針在大穎野生稻的Ｃ染色體組上有較強的雜交信號。但是，大穎野生稻Ｃ基因組在進化過程中的變異也很明顯。根據基于GＩＳＨ圖像的大穎野生稻染色體核型分析發現，藥用野生稻Ｃ基因組ＤＮＡ探針在大穎野生稻的Ｃ染色體組上并不是整體覆蓋，在一些染色體的染色體臂或著絲粒、近著絲粒、端粒區域沒有信號分布，說明了這些區域在進化中發生了變化，這些變化可能包括染色體重組，染色體缺失、易位、重排等［１５－１９］。

有研究表明染色體的著絲粒、近著絲粒、端粒區域是中高度重復序列（Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ）主要富集區域。由于在這些區域功能基因的密度較小，中高度重復序列在進化過程中具有受到選擇壓力小、變異速度快的特點［１４，１５］，使得Ｃ0ｔ－１ ＤＮＡ具有很強的種的特異性和依賴基因組型的特異性［６］。因此，用Ｃ0ｔ－１

ＤＮＡ作為探針進行熒光原位雜交，能夠在細胞學水平上將不同物種的基因組快速、直觀地展現辨別出來。用藥用野生稻Ｃ基因組Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ為探針，對大穎野生稻進行ＦＩＳＨ分析，同樣也發現了大穎野生稻Ｃ染色體組與Ｄ染色體組具有較遠的親緣關系，以及大穎野生稻Ｃ基因組和藥用野生稻Ｃ基因組之間的分化。從兩種探針在大穎野生稻體細胞染色體上的雜交信號圖來看，用Ｃ基因組Ｃ0ｔ－１ＤＮＡ探針比Ｃ基因組ＤＮＡ探針具有較少的雜交信號，但是特異性更強，特別是在一些Ｄ染色體組上，在著絲粒、近著絲粒、端粒區域檢測的信號較少，或幾乎檢測不到雜交信號。

作為四倍體物種，大穎野生稻中共存的Ｃ染色體組和Ｄ染色體組的起源是一個復雜的問題。研究認為其中Ｃ染色體組與藥用野生稻的Ｃ基因組具有較近的親緣關系，它們可能存在相似的起源。而其中的Ｄ染色體組與Ｃ染色體組具有較大的差異，大穎野生稻中的這兩組染色體并不是其中一種染色體組經過簡單的加倍而形成，推測可能是不同來源的染色體組通過種間雜交和加倍，形成現在穩定遺傳的四倍體大穎野生稻［２０－２３］。因此，研究分析大穎野生稻Ｃ染色體組和Ｄ染色體組的差異和親緣關系及其進化機制，為以后能更進一步區分大穎野生稻、寬葉野生稻、高稈野生稻基因組之間的異同，以及探討異源四倍體進化機制奠定了基礎。

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［２０］ ＬＩ Ｃ Ｂ，ＺＨＡＮＧ Ｄ Ｍ，ＧＥ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｍａｌａｍｐｕｚｈａｅｎｓｉｓ， Ｏ． ｍｉｎｕｔａ，ａｎｄ Ｏ． ｐｕｎｃｔａｔａ ｂｙ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００１，１０３：２０４－２１１．

［２１］ ＨＡＮ Ｆ，ＦＥＤＡＫ Ｇ，ＧＵＯ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｌｉｃ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔ（ｐＧｃ１Ｒ－１ａ） ｉｎ ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｗｈｅａｔ ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，１７０：１２３９－１２４５．

［２２］ ＨＡＬＬ Ａ Ｅ， ＫＥＩＴＨ Ｋ Ｃ， ＨＡＬＬ Ｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅｓ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ， ２００４， ７： １０８－１１４．

［２３］ ＭＡ Ｘ Ｆ，ＧＵＳＴＡＦＳＯＮ Ｊ Ｐ．Ｔｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｉｔｉｃａｌｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：９５０－９５８．

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