攀枝花余甘子多糖的提取研究

摘要：運用正交設計，以料液比、提取溫度和提取時間為因素，考查３個因素對提取攀枝花地區野生余甘子果實多糖的影響。最佳工藝條件為，料液比為１∶２０（ｍ∶ｍ，下同），提取溫度為１００ ℃，提取時間為３．０ ｈ，余甘子多糖的含量為５．９１％。

關鍵詞：多糖；余甘子；正交設計

中圖分類號：Ｒ２８２．７；Ｏ６２９．１２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2523-03

Study on Polysaccharide Extraction from Phyllanthus emblica in Panzhihua

ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ１ａ，1ｂ，ＬＩ Ｍｉｎ－ｊｉｅ１ａ，1ｂ，ＹＡＮＧ Ｇｅ2

（１.Ｐａｎｚｈｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｂ． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ， Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００，Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｆｒｕｉｔ ｉｎ Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ． ｉｎ Ｐａｎｚｈｉｈｕａ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶２０（m∶m）； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ， ３.0 ｈ； ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， １００ ℃． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ５．９１％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ．； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ

余甘子（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ．）即滇橄欖（大戟科Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ，葉下珠屬Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ），是一種十分獨特的生長在中國亞熱帶、熱帶部分地區，特別是干熱河谷地區的落葉喬木或灌木資源植物［１］。余甘子是藥食兩用的具有保健功能的經濟資源植物，果實在我國作為中藥，包括藏醫藥等民族藥用植物記載使用已有２ ０００年歷史［２］。全世界有將近２０多個國家或民族在自己的傳統藥物體系中使用余甘子，這與其有多種治療功效有關，其主要用作輕瀉劑、抗病毒、抗細菌和真菌、抗氧劑、利尿劑，用于口腔疾病、糖尿病、腹泄、發燒、發炎等多種病癥的治療。藥理研究結果也表明，余甘子具有抗微生物感染、抗氧化、抗腫瘤、降血脂和血糖、降壓、補益等多種生物活性，且無明顯的毒副作用［３］。

目前國內對余甘子藥用成分的研究主要集中在余甘子沒食子酸、揮發油、槲皮素、游離氨基酸、多酚類物質、超氧化物歧化酶等方面［４，５］，對余甘子多糖的研究還比較少見。余甘子多糖作為余甘子的主要組分之一，其提取工藝和生理活性的研究必將會給人類對抗疾病困擾帶來新的有力武器。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１植物材料樣品采自攀枝花市仁和區，采取野生余甘子新鮮果實。取顆粒大小、飽滿程度、色澤都較均勻的果實洗凈，６０ ℃烘干，粉碎后經１００目篩過篩，得干粉備用。

１．１．２試劑石油醚、無水乙醇、苯酚、無水葡萄糖、乙醚、濃硫酸，均為分析純，均產自成都市科龍化工試劑廠。

１．１．３儀器ＡＰ－０２真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；ＨＲ／０６／ＢＣ攪拌機（珠海飛利浦家庭電器有限公司）；７２２可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；ＹＰ２０２Ｎ電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；８００２ ＴＤＡ溫度控制儀（北京市永光明醫療儀器廠）；２０２－２ＡＢ電熱恒溫干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司）；索氏回流器等。

１．２方法

１．２．１葡萄糖標準液的配制準確稱取１０５ ℃干燥至恒重的無水葡萄糖１００ ｍｇ，用去離子水定容至１００ ｍＬ，再取該溶液１０ ｍＬ用去離子水定容至１００ ｍＬ，即得１００ μｇ／ｍＬ的葡萄糖標準液。用吸量管準確移取苯酚５ｍＬ，去離子水定容至１００ｍＬ，即得５％苯酚液，棕色瓶中避光保存。?。钢崈粼嚬埽謩e精密量?。埃?、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ ｍＬ葡萄糖溶液，加去離子水至２ ｍＬ，再分別加入５％苯酚液１ ｍＬ，搖勻后迅速加入５ ｍＬ濃硫酸，搖勻放置５ ｍｉｎ，置沸水浴中加熱１５ ｍｉｎ取出冰浴冷卻至室溫，以空白試液為對照，在最大吸收波長即４９０ ｎｍ處測定吸光度（Ａ）。以吸光度（Ａ）為縱坐標，葡萄糖濃度（Ｃ）為橫坐標繪制標準曲線，并求回歸方程。

１．２．２石油醚去脂稱取余甘子果實干粉１０ ｇ，置于索氏回流器中，經石油醚（３０～６０ ℃）２５０ ｍＬ回流抽提脫脂１次，時長１．０ ｈ。

１．２．３溫水浸提將余甘子干粉置于５００ ｍＬ燒杯中，按設定料液比加水并在燒杯口加蓋三分之二玻璃片，防止水分過量蒸發，置于ＴＤＡ溫度控制儀中，在設定溫度水浴浸提數小時，提取兩次。

１．２．４過濾沉淀將提取液進行抽濾，棄去濾渣。按１∶４（濾液∶無水乙醇）體積比［６］加入無水乙醇于濾液，靜置２４ ｈ［７］后抽濾，棄去濾液，濾渣用藥匙刮至培養皿中。將培養皿置于電熱恒溫干燥箱中，６０ ℃恒溫干燥，得黃白色粉末，即得余甘子多糖粗品。

１．２．５粗多糖的多糖含量測定精密稱取干燥至恒重的粗余甘子多糖１００ ｍｇ，用去離子水高溫溶解后冷卻至室溫，稀釋定容至１００ ｍＬ，再?。保?ｍＬ該溶液稀釋定容至１００ ｍＬ，即配制成了１∶１ ０００的粗多糖溶液。用吸量管精密吸取該溶液２ ｍＬ于試管中以標準曲線繪制項操作，于４９０ ｎｍ波長處測定其吸光度并帶入回歸方程計算多糖含量。樣品中的多糖含量＝（Ｃ×Ｖ×Ｄ×１０－６）／（２×Ｗ粗）×１００％，其中，Ｃ——吸光度測定的溶液中多糖濃度（μｇ／ｍＬ），Ｖ——待測液體積（ｍＬ），Ｄ——稀釋倍數，Ｗ粗——稱取的粗多糖質量（ｇ）。

２結果與分析

２．１標準曲線繪制

取吸光度（Ａ）對葡萄糖液濃度（Ｃ）進行線性回歸，得回歸方程及標準曲線（圖１）。

２．２單因素試驗

２．２．１料液比對多糖含量的影響精密稱取余甘子干粉１０ ｇ，分別采用１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０的料液比，提取溫度９０℃，提取時間２．０ ｈ。研究料液比對余甘子多糖提取的影響，共做３組平行試驗。由圖２可知，在提取溫度和提取時間相同的條件下，料液比從１∶１５變為１∶２０的過程中，多糖含量上升，１∶２０時含量最高，達到了５．０７％。

２．２．２提取時間對多糖含量的影響精密稱取余甘子干粉１０ ｇ，采用１∶２０的料液比，提取溫度９０℃，提取時間分別為１．０、２．０、３．０、４．０ ｈ，研究提取時間對余甘子多糖提取的影響，共做３組平行試驗。在提取溫度和料液比相同的條件下，提取時間從１．０ ｈ上升到３．０ ｈ的過程中，多糖含量也隨之上升，在提取時間為３．０ ｈ時含量達到最大，為５．５３％。之后，提取時間再增加，多糖含量反而下降。

２．２．３提取溫度對多糖含量的影響精密稱取余甘子干粉１０ ｇ，采用１∶２０的料液比，提取溫度分別為７０、８０、９０、１００ ℃，提取時間２．０ ｈ，研究提取溫度對余甘子多糖提取的影響，共做３組平行試驗。在提取溫度從７０ ℃上升到９０ ℃的過程中，多糖含量也在逐步上升，并且在９０ ℃時含量達到最大，為５．３２％。在此提取溫度基礎上，若再增加溫度，多糖含量則下降。

２．３正交試驗

２．３．１正交設計單因素試驗結果表明，在其余兩因素條件相同，料液比為１∶２０，提取時間為３．０ ｈ，提取溫度為９０ ℃時多糖含量最高。因此選取料液比、提取時間和提取溫度作為考察因素，每因素擬定３個水平，運用Ｌ９（３４）正交表（表１），確定余甘子多糖的最佳提取工藝。多糖含量結果見表２。

由正交結果極差分析可知，３個因素對余甘子多糖的影響效果分別為：料液比＞提取溫度＞提取時間。

ＳＰＳＳ１３．０方差分析表顯示，料液比的Ｐ值為０．０２４，料液比不同水平對多糖含量的影響顯著。由均值比較，料液比１∶２０條件下提取結果較好。料液比太低會使提取溶液黏度太高，原料粉與水難以充分混合，不利于多糖溶出，得到的多糖含量不高。料液比太高會使提取液中多糖濃度降低，而且會增加后續工藝中的提取液的濃縮度和醇沉中的酒精用量，浪費工藝成本。提取溫度的Ｐ值為０．０３７，說明不同水平對多糖含量影響顯著。由均值可得出，１００ ℃條件下的多糖提取結果較好。過高的提取溫度會破壞多糖結構、使有些多糖發生降解而影響其生物活性，而且在實際生產中，過高的溫度會增加能耗和成本的投入。提取時間的方差分析Ｐ值為０．０７３，對多糖含量影響不顯著。提取時間太短不利于多糖的溶出，從而降低多糖提取得率。提取時間太長會使多糖在高溫提取過程中的時間過長，而使部分多糖破壞和降解，降低多糖的得率。綜合試驗結果并考慮實際應用成本等因素，確定最佳提取工藝條件為余甘子果實干粉脫脂后，以２０倍加水量提取兩次，每次３．０ ｈ，提取溫度１００ ℃。

２．３．2工藝驗證按照正交試驗所確定的優選工藝條件，進行驗證試驗５次，結果見表４。試驗測定多糖平均含量為５．９１％，ＣＶ為０．６７％，結果表明該提取工藝穩定可行。

３討論

通過試驗探索了用“水提醇沉法”提取余甘子多糖的最佳工藝條件，考察了料液比、提取時間和提取溫度對水提法提取余甘子多糖時得率的影響。并在單因素試驗基礎上進行了三因素三水平正交試驗，以確定最佳的提取條件。試驗結果表明，料液比和提取溫度對多糖含量的影響顯著，提取時間對多糖含量的影響不顯著。水提醇沉法提取余甘子多糖的最佳條件為，料液比為１∶２０，１００ ℃下提?。常?ｈ，多糖含量為５．９１％。

相比酶提法、超聲法和超臨界萃取法等，醇沉水提法提取效果稍差。但考慮實際成本和某些負效應，如酶法降解副產物對提取會有影響，超聲波的凝聚作用以及熱點作用下多糖的降解問題等［８，９］，本課題雖采用了較傳統和保守的水提法，但是根據所得的試驗結果來看，多糖含量較高，提取效果比較理想。

試驗旨在為余甘子果酒制作提供一定的參考數據，未涉及余甘子植株其他部位多糖含量的研究。已有研究表明，余甘子植株除了果實以外的其他部分如根、葉、芽、種子、莖等也含有相當高的多糖含量。在某些品種余甘子植株中，果實以外的多糖含量甚至高于果實本身［１０］。

余甘子屬于攀西干熱河谷地區的特色植物資源，入藥食用皆宜。目前攀西地區的余甘子多糖提取研究未見相關報道，研究成果具有一定的參考意義。余甘子多糖提取的影響因素復雜，包括料液比、提取時間、提取溫度、提取次數、醇沉濃度、醇沉時間等，本研究僅取前３個常見因素作正交優選。今后有必要進一步就原料和工藝兩方面比較余甘子植株其他器官的多糖含量和提取工藝中的其他因素的影響效果。

參考文獻：

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