烏拉爾甘草愈傷組織石蠟切片與半薄切片的對比

摘要：以烏拉爾甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．）不同來源愈傷組織為材料，采用石蠟切片和半薄切片技術，對烏拉爾甘草不同來源愈傷組織細胞進行了觀察，結果表明，半薄切片在制作不同來源愈傷組織裝片時優于石蠟切片，其清晰度高，分辨率更為精確。石蠟切片中，根源愈傷組織有核細胞較少，而且細胞出現解體現象；半薄切片中觀察到了葉源愈傷組織細胞中的著色顆粒、線粒體和圓球體，可為透射電鏡制樣提供有效的材料。

關鍵詞：烏拉爾甘草；愈傷組織；石蠟切片；半薄切片

中圖分類號：Ｓ５６７．７＋１；Ｑ９４３．１；Ｑ９４－３３６文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）12－2487-03

Comparison of Paraffin Section and Semi-Thin Section of Glycyrrhiza uralensis Callus

ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ１，ＣＡＯ Ｊｕｎ－ｍａｉ１，ＬＩＵ Ｊｉａｎ－ｌｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ２，ＺＨＥＮＧ Ｓｕ－ｊｉａｏ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｅｌｌs ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ． ｃａｌｌｕｓ ｗere ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔａｋｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｇ． ｕｒａｌｅｎｓｉｓ ａｓ ｔｒｉａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｍａｋｉｎｇ ｓｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ． Ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ， ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ Ｇ． ｕｒａｌｅｎｓｉｓ ｒｏｏｔｓ ｈａｄ ｆｅｗ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ； Ｃｏｌｏｒｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｓｐｈｅｒｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ be ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｃｌｅａｒｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．； ｃａｌｌｕｓ； ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ； ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ

石蠟切片是組織學、發育生物學研究的主要試驗方法，其優點是適合多數植物做組織切片觀察，因而有關研究石蠟切片的報道文獻較多［１－６］。半薄切片也是一種常用的制片技術，半薄切片制備中的一些關鍵技術如切片、撈片、脫脂、染色等環節直接影響半薄切片的質量；半薄切片在制作不同植物愈傷組織裝片時優于石蠟切片，能較好地保存組織細胞的結構，其清晰度高，分辨率更為精確，但較石蠟切片成本高；而用于烏拉爾甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．）愈傷組織細胞結構觀察的石蠟切片與半薄切片比較分析研究尚未見報道，為此開展了這方面的研究，現將結果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

用烏拉爾甘草的根、芽、葉誘導的愈傷組織由北方民族大學細胞生物學實驗室提供。染料有番紅、固綠、甲苯胺藍，試劑有冰醋酸、甲醛、二甲苯、石醋、３％戊二醛、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（pH值6.8）、１％鋨酸、梯度酒精（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％）、環氧丙烷、環氧樹脂、十二烷基琥珀酸酐、鄰苯－二甲酸二丁酯、２，４，６－三甲氨基苯酚等，均為分析純。儀器主要是Ｏｌｙｍｐｕｓ生物顯微鏡、實驗型冰箱、溫箱、包埋板、切片機等。

１．２方法

１．２．１石蠟切片制作取烏拉爾甘草不同來源的愈傷組織，進行常規石蠟切片制作［７］，用番紅和固綠進行雙重染色。

１．２．２半薄切片制作①取材及固定。沿著烏拉爾甘草不同來源愈傷組織的生長方向，將其切成 ０．５～１．０ ｍｍ３大小的小塊；把切割下來的材料浸入３％戊二醛中，并將其置于４ ℃的冰箱中固定５ ｈ（前固定）；將材料從固定液中取出，用０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ｐＨ值６．８）洗滌３～４次，每次３０ ｍｉｎ，可不斷地搖動容器，使緩沖液迅速進入組織取代殘存的戊二醛溶液；將洗滌的材料放入１％鋨酸中，于４ ℃冰箱中放置１６ ｈ（后固定）；將后固定的材料取出，用０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液洗滌３次，每次３０ ｍｉｎ，洗去細胞中殘存的鋨酸。②脫水及滲透。采用酒精，按３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％（２次）進行梯度處理，每級梯度處理１０ ｍｉｎ，但１００％酒精處理１５ ｍｉｎ。環氧丙烷滲透（２次）１５ ｍｉｎ；用一份不完全包埋液加一份環氧丙烷溶液滲透１ ｈ；用兩份不完全包埋液加一份環氧丙烷溶液滲透１ ｈ；然后在完全包埋液中過夜，包埋液配方為環氧樹脂４．５０ ｇ、十二烷基琥珀酸酐４．５０ ｇ、鄰苯－二甲酸二丁酯０．１５ ｇ、２，４，６－三甲氨基苯酚０．０７５ ｍＬ。③包埋。完全包埋液浸泡材料于３５ ℃溫箱６ ｈ，轉移至包埋板，４２ ℃溫箱過夜。④切片、展片及粘片。先將愈傷組織小塊切成正方體或長方體，展片時，在清潔的載玻片上加一滴去離子水，再將切下的組織塊放在水滴的表面，然后展片（包埋劑不必除去，它本身與玻璃還有一定的粘著力，也可不使用粘著劑進行粘片）；待切片平展后，用紗布或吸水紙吸取多余的水分，在平臺上使水分完全蒸發即可。⑤染色。將甲苯胺藍染液滴在載玻片的材料上１～２ ｍｉｎ，去離子水清洗，并在室溫下干燥［８］。

１．２．３觀察拍照挑取制作效果好的裝片，在Ｏｌｙｍｐｕｓ顯微鏡下，利用Ｍｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ ３．２軟件進行拍照。

２結果與分析

２．１不同來源愈傷組織石蠟切片的觀察

對烏拉爾甘草不同來源的愈傷組織石蠟切片的觀察結果見圖１，由圖１可見，番紅將細胞核染成玫紅色；固綠將細胞質、細胞壁染為綠色。由此可清晰地看出根源愈傷組織細胞排列疏松，細胞質著色淺，有核細胞少，且細胞出現解體現象；葉源愈傷組織細胞排列較緊密，細胞質著色淺，有核細胞多；芽源愈傷組織細胞排列緊密，細胞質著色濃，有核細胞多且密集。這說明不同來源愈傷組織的細胞存在組織結構上的差異，特別是根源愈傷組織的無核細胞多，導致分生能力低，為再分化的實現加大了技術難度。

２．２不同來源愈傷組織半薄切片的觀察

對烏拉爾甘草不同來源的愈傷組織半薄切片的觀察結果見圖２，由圖２可見，根源愈傷組織細胞質著色程度不同，液泡未著色，呈白色，且可以看到細胞質內有較多著色顆粒具有細胞核，細胞液泡化程度低，說明細胞分裂不旺盛，但細胞內貯藏的物質較多；葉源愈傷組織細胞質部分被著色，液泡化程度較高，還可以看到著色的線粒體和圓球體，說明細胞分裂較旺盛；芽源愈傷組織大部分細胞未著色，液泡多，液泡化程度高，且可以看到較多的著色顆粒，說明細胞分裂旺盛。將這個觀察結果與石蠟切片觀察結果進行比較，可以清楚地看到，通過半薄切片技術可以更加全面地反映出烏拉爾甘草不同來源愈傷組織細胞的分裂狀況。

３討論

石蠟切片在制片過程中要經過酒精、二甲苯等有機溶劑的處理，組織內活性物質如蛋白質會產生變性或酶失活，還有某些內含物易于消失，常使組織變小，甚至使組織扭曲變形，細胞所含物質縮小而折光性增強，影響觀察結果的客觀性。半薄切片圖像的清晰度、分辨率遠優于石蠟切片，視野也大于石蠟切片，有利于獲得高質量的光鏡圖像，但成本高于石蠟切片。此外，還可為透射電鏡制樣提供有效的材料。

番紅－固綠對染法是植物切片中最常見的二重染色方法，番紅是堿性染料，能使細胞核及木質化的細胞壁著色；固綠是酸性染料，能使細胞質著色。在圖１中可見，烏拉爾甘草根源愈傷組織有核細胞較少，而且細胞出現解體現象，這說明烏拉爾甘草根源愈傷組織細胞不再具有分生能力，而轉化為儲藏細胞或通氣組織，此觀點與孔妤等［9］的研究結果相一致。甲苯胺藍是堿性染料，著色物質是蛋白質顆粒或含有蛋白質的物質，對液泡不著色。從圖２中可明顯地看出，烏拉爾甘草芽源愈傷組織液泡化程度最高，其次為葉源愈傷組織，根源愈傷組織液泡化程度最低，從這點也證明了不同來源愈傷組織分生能力的強弱。

試驗在半薄切片中，觀察到了細胞中的著色顆粒、線粒體和圓球體；而在石蠟切片中僅觀察到了著色的細胞核，其他結構不能觀察到。分析原因，可能是由于烏拉爾甘草愈傷組織為幼嫩材料，在各級脫水時間、酒精梯度處置及透明時間、浸蠟溫度等環節里，都出現了影響制片質量的問題，由此說明這些顯微結構的不同，可能與不同來源愈傷組織分生能力不同有關聯。

參考文獻：

［１］ 路健，王伶． 石蠟切片制作中的問題與解決［Ｊ］． 山西醫科大學學報（基礎醫學教育版），２００１，３（３）：２６３．

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［３］ 楊捷頻． 常規石蠟切片方法的改良［Ｊ］． 生物學雜志，２００６，２３（１）：４５－４６．

［４］ 楊群，胥維勇． 影響組織切片制作質量幾個因素的分析及改進方法［Ｊ］． 中國組織化學與細胞化學雜志，２００５，１４（１）：１１９－１２０．

［５］ 李曉梅． 大豆莖頂端分生組織石蠟切片的制備［Ｊ］． 大豆科學，２００８，２７（４）：７０８－７１０．

［６］ 曹君邁，趙海燕，楊歡歡． 甘草兩種類型愈傷組織的細胞學顯微結構觀察［Ｊ］． 安徽農業科學，２００９，３７（４）：１６１１－１６１３．

［７］ 王金發，何炎明． 細胞生物學實驗教程［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００３． ４２－５０．

［８］ 劉冬娟，祝素文，李艷杰． 硼砂甲苯胺藍染液在半薄切片染色上的應用［Ｊ］． 中國醫科大學學報，２００４，３３（１）：３３．

［9］ 孔妤，王忠，顧蘊潔，等． 植物根內通氣組織形成機理的研究進展［Ｊ］． 植物學報，２００8，25（2）：248-253．

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