金線蘭愈傷組織誘導的最佳激素配比

摘要：以金線蘭根狀莖、幼莖、葉片、離體胚為外植體，４種激素２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ采用Ｌ９（３４）正交表處理，對愈傷組織誘導的條件進行研究。結果表明，６－ＢＡ和２，４－Ｄ在誘導金線蘭愈傷組織中作用極為顯著，４種激素對愈傷組織的誘導作用大小依次為，６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ，初步斷定金線蘭愈傷組織誘導的最佳激素配比是０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ；根狀莖和幼莖作為外植體更易誘導愈傷組織形成；暗培養較光暗交替更易誘導愈傷組織生長。

關鍵詞：金線蘭；愈傷組織；誘導；條件

中圖分類號：Ｓ６８２．３１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2568-03

Study on the Optimum Hormone Ratio Inducing Callus of Anoectochilus roxburghii

ＬＩＮ Ｈａｉ，ＨＡＯ Ｈｕｉ－ｍｉｎ

（Ｒｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｅｂｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，Ｈｅｂｉ ４５８０３０，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｍｅ， ｌｅａｆ ｂｌａｄｅ， ｓｔｅａｍ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ， ２，４－Ｄ， ６－ＢＡ， ＮＡＡ ａｎｄ ＺＴ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ６－ＢＡ ａｎｄ ２，４－Ｄ ｐｌａｙｅｄ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ． Ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｗａｓ ６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｉ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｗａｓ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ． Ｉｎｄｕｃｉｎｇｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｗａｓ ｅａｓｉｅｒ； ａｎｄ ｃａｌｌｕｓ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ； ｃａｌｌｕｓ； inducement； ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

金線蘭［Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ（Ｗａｌｌ．）Ｌｉｎｄｌ．］，蘭科開唇蘭屬植物，全草入藥，味甘、性平，具有清熱涼血、除濕解毒的功效，可治療肺結核、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無力、遺精、風濕性及類風濕性關節炎、小兒驚風、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥，是民間珍稀名貴的中草藥［１］。除藥用外，由于株型矮小，葉型優美，葉面黑紫色，有金黃色帶有絹絲光澤的美麗網脈，是觀賞價值極高的室內觀葉珍品，具有廣闊的開發利用前景。

金線蘭種子自然條件下萌發率很低，再加上過度采集，野生資源日益枯竭［２］。在人工培養條件下誘導愈傷組織生長并使其增殖是實現快繁和分離其次生代謝產物獲取金線蘭藥用成分的重要途徑，但目前罕見金線蘭愈傷組織誘導的研究報道。采用正交試驗研究了４種激素對誘導愈傷組織生長的影響，為金線蘭愈傷組織誘導和細胞培養體系的建立提供依據。

１材料與方法

１．１材料

外植體：于花卉市場采購金線蘭植株。

金線蘭離體胚：于市場采購金線蘭種子，清水浸泡２４ ｈ，剝取離體胚。

１．２方法

１．２．１培養基及外植體的消毒與接種培養基：ＭＳ基本培養基＋３0．０ g/L蔗糖＋８.0 g/L瓊脂，附加不同濃度的２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ，ｐＨ值為５．８～６．０，每１５０ ｍＬ三角瓶中加培養基３０～４０ ｍＬ，滅菌２０ ｍｉｎ，雙層牛皮紙封口，滅菌后１～２ ｄ備用。外植體消毒：在超潔凈工作臺上進行操作，將金線蘭芽的尖端部分、幼嫩的根狀莖、新生葉片用清水沖洗干凈后，再用去離子水沖洗５次，用體積分數為７５％的酒精浸泡３０ ｓ后再用無菌水沖洗３次，０．１ g/100mL的ＨｇＣｌ２浸泡８～１０ ｍｉｎ，再用無菌水沖洗３次，即完成消毒。接種：消毒后的材料置于無菌濾紙上吸干水分，然后將材料切割成適量大小接種到加有不同濃度激素的培養基中。

１．２．２試驗處理根狀莖處理：基本培養基為ＭＳ＋３0．０ g/L蔗糖＋８.0 g/L瓊脂，激素選取２，４－Ｄ、６－ＢＡ，激素處理如表１。每種激素處理接種１２瓶，６瓶于光暗交替下培養；６瓶于暗處培養。光暗交替培養放在日光燈照明的培養架上，每天８∶００－１８∶００照明，溫度設置為２０ ℃恒溫培養；暗處培養的放在２０ ℃培養箱中培養，濕度為８５％～９０％。每隔１０ ｄ觀察記錄每種處理外植體的變化，并對發生變化的外植體進行數碼拍照。

幼莖、葉片及離體胚處理：基本培養基為ＭＳ＋３0．０ g/L蔗糖＋8.0 g/L瓊脂，選取２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ ４種激素處理，每種激素取３個水平，利用Ｌ９（３４）正交表，考察４種激素對金線蘭愈傷組織誘導的影響，激素處理見表２。每種處理接種６瓶，離體胚每種處理接種２瓶，暗處２０℃培養，濕度為８５％～９０％。每隔１０ ｄ觀察外植體變化并記錄。

２結果與分析

２．１對根狀莖誘導愈傷組織結果進行觀察并分期照相

光暗交替下的金線蘭愈傷組織生長的較疏松，為綠色團塊狀，而暗處理下金線蘭愈傷組織較緊密，白色或略帶黃色。光暗交替培養，①處理在第６０天時有新的須根出現，７０ ｄ時須根下面生成不規則突起，８０ ｄ時變成類似芽狀的組織，９０ ｄ時生成花蕾樣突起；③處理在８０ ｄ時才有新根出現，９０ ｄ時須根變長；④處理外植體表面在２０ ｄ時有短細毛出現，９０ ｄ時表皮開裂（圖１、２）；⑧處理在９０ ｄ時下部生成一突起。暗處培養的金線蘭，①處理在４５ ｄ時有須根出現，５５ ｄ時出現芽狀體，６５ ｄ時出現不規則突起；④處理直到６５ ｄ時都沒有什么變化。其他處理則因染菌外植體全部死亡。

金線蘭根狀莖誘導愈傷組織生長的基本情況，金線蘭莖在１０ ｄ左右切口便可觀察到白色致密的顆粒狀愈傷組織，３０ ｄ時愈傷組織生長達到最大速度。低濃度處理的金線蘭外植體在暗處培養４５ ｄ時出現須根，６５ ｄ左右出現芽狀體，光暗交替培養的條件下６０ ｄ出現須根，８０ ｄ左右才出現芽狀體。因此金線蘭根狀莖誘導愈傷組織生長在暗培養條件較光暗交替條件好。

２．２不同激素處理對金線蘭葉片愈傷組織的誘導

在整個試驗過程中，對葉片進行愈傷組織誘導的培養基中，部分葉片在３０ ｄ時沒有明顯出現愈傷組織，大部分葉片外緣及脈線處變黑或已經死亡，造成這種結果的原因可能是由于消毒時間過長或消毒液濃度過高，葉片過于幼嫩造成死亡或培養基的激素配比不適合葉片愈傷組織的誘導。

２．３不同激素處理對金線蘭離體胚愈傷組織的誘導

接種１０ ｄ后離體胚看不出變化，３０ ｄ時可觀察到部分處理中離體胚膨脹伸長，但不明顯。

２．４不同激素處理對金線蘭幼莖愈傷組織的誘導

接種１０ ｄ后金線蘭幼莖切口處出現白色點狀物質，２０ ｄ后白色點狀物質逐漸擴大，形成一層薄薄的愈傷組織，３０ ｄ后統計各處理誘導愈傷組織的數目。

通過６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＮＡＡ、ＺＴ ４種激素３個水平９個濃度組合的正交試驗發現各種組合對金線蘭愈傷組織誘導的影響差異很大，通過對試驗結果進行極差分析［３］， ４種激素對愈傷組織的誘導作用大小依次為６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ。金線蘭愈傷組織最佳激素配比可初步斷定為０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ，且該結果和試驗中處理組③誘導率最大基本吻合（表３）。但因試驗各處理的重復中愈傷組織誘導率差異較大，故而試驗的可行性較差，最佳激素配比仍需進一步試驗驗證，由表可以看出６－ＢＡ、２，４－Ｄ為金線蘭愈傷組織誘導的主要因素，是否６－ＢＡ、２，４－Ｄ兩者的組合更適合誘導金線蘭愈傷組織尚需進一步試驗。

２．５外植體大小對愈傷組織誘導的影響

以金線蘭幼莖為外植體，當莖直徑小于０．５ ｃｍ時，從接種第七天開始，莖兩端切口處漸漸變黃，隨著時間的延長，色澤逐漸加深，２０ ｄ時變成深褐色，且部分外植體切口分泌出淡黃色液體，３０ ｄ時部分幼莖漸漸發黑死掉。當外植體莖直徑大于０．５ ｃｍ時，接種１０ ｄ開始在切口處愈傷組織以點狀出現，１５ ｄ時已能看到薄薄的一層白色結晶狀物質，３０ ｄ時，形成白色較致密的愈傷組織。呂玉虎等［４］研究認為外植體在培養基上的不同放置方式對百合鱗片愈傷組織誘導也有影響，其誘導出芽能力從強到弱依次為：鱗片內側向上＞鱗片豎直插入＞鱗片內側向下平放。金線蘭外植體的放置方式是否影響到愈傷組織的生長還需進一步研究。在試驗中，金線蘭莖水平放置和垂直放置（一切口接觸培養基）兩者的愈傷組織生長情況有明顯的差別，垂直放置生成愈傷組織的量多且愈傷組織較致密、生長旺盛，水平放置愈傷組織生成量少、疏松且生長較慢。

３討論

１）在試驗過程中外植體或愈傷組織發生褐化現象，其原因是多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化為活性酸化物和環形多聚體氧化蛋白質時形成深色化合物，這些物質很快又被氧化和形成復雜的醌類物質，從而導致外植體組織或細胞逐漸變成褐色或黑色，最后死亡［５，６］。據報道，加入抗氧化劑或吸附劑對抑制褐化有明顯的效果，在試驗中通常采用ＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）和活性炭抑制褐變［７，８］。表３可看出金線蘭愈傷組織褐化率比較高，這是因為培養基中沒有加入抑制劑。

２）根據細胞全能性理論，植物任何器官都可以用作外植體，但不同組織器官培養成功的難易程度是不同的，同一種植物不同的組織和器官再生能力也有很大差異［９］。試驗中取根狀莖、幼莖、葉片、離體胚為外植體，結果表明，只有根狀莖和幼莖易產生愈傷組織，愈傷組織布滿切口或外側、質地緊密、時間相對短，且誘導率較高。離體胚愈傷組織形成不明顯。葉片在消毒時被殺死，無愈傷組織生成。根狀莖、幼莖和離體胚誘導愈傷組織能力不同證明不同器官和組織的再生能力不同。

參考文獻：

［１］ 中國科學院中國植物志編委會． 中國植物志［Ｍ］． 北京：科學出版社，２０００． ２２０．

［２］ 陳浴，林坤瑞，管其寬，等． 金線蓮生物學特性及生境特點的研究［Ｊ］．亞熱帶植物通訊，１９９４，２３（１１）：１８．

［３］ 徐吉民． 正交法在醫藥科研中的應用［Ｍ］． 北京：醫藥科學技術出版社，１９８７． ３６．

［４］ 呂玉虎，李彬青， 吳淑平， 等． 百合的離體組織培養和快速繁殖［Ｊ］． 信陽農業高等專科學校學報，２００２，１２（２）：１９－２０．

［５］ 陳菲，李黎，宮偉． 植物組織培養的防褐化探討［Ｊ］． 北方園藝，２００５（２）：６９．

［６］ 張明文，陳力耕． 銀杏組織培養中控制褐化的研究［Ｊ］．中國南方果樹，２００３，３２（３）：５１－５２．

［７］ 郭勇，崔唐兵，謝秀禎． 植物細胞培養技術與應用［Ｍ］．北京：化學工業出版社，２００３．１２．

［８］ 薛建平，柳俊，蔣細旺． 藥用植物生物技術［Ｍ］． 合肥：中國科學技術大學出版社，２００５．３．

［９］ 毛子成，彭正松． 半夏快速繁殖體系的研究進展［Ｊ］．中國中藥雜志，２００３，２８（３）：１９３－１９５．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文