重組aFGF乳酸菌的構(gòu)建\\表達(dá)及其對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效研究

摘要：采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ａｃｉｄic ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ， ａＦＧＦ）基因序列的乳酸菌重組表達(dá)載體ｐＧＭＮ４，轉(zhuǎn)化并篩選出高效表達(dá)ａＦＧＦ的重組菌株，制成活菌制劑。口服５％葡聚糖硫酸鈉（ＤＳＳ）溶液７ｄ誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ， ＵＣ），在造模同時(shí)分別給予高、中、低劑量活菌制劑灌胃１７ｄ。通過比較小鼠的毛色、體重、便血、結(jié)腸長(zhǎng)度、病變組織的髓過氧化物酶（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， ＭＰＯ）活性，以及觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化，驗(yàn)證重組ａＦＧＦ乳酸菌對(duì)ＤＳＳ誘導(dǎo)的小鼠ＵＣ的預(yù)防和治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組ａＦＧＦ乳酸菌的表達(dá)量可達(dá)５０μｇ／ｍＬ，高劑量重組活菌制劑能夠顯著改善小鼠的一般情況和潰瘍導(dǎo)致的結(jié)腸縮短，促進(jìn)組織修復(fù)，保持結(jié)腸結(jié)構(gòu)的完整性，并下調(diào)ＭＰＯ的活性。重組ａＦＧＦ乳酸菌對(duì)小鼠ＵＣ具有良好的預(yù)防和治療效果，將為ＵＣ治療制劑的開發(fā)提供更加廣闊的思路。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；潰瘍性結(jié)腸炎

中圖分類號(hào)：Ｑ８１５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）12－2508-03

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ａｃｉｄｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ

ＴＯＮＧ Ｌｅｉａ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ－ｈａｏａ，ｂ，ＱＩＵ Ｚｈｕａｎｇ－ｗｅｉａ，ＳＵ Ｚｈｉ－ｊｉａｎａ，ｂ，ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ－ｘｉａａ，ＨＵＡＮＧ Ｙａ－ｄｏｎｇａ，ｂ

（ａ． Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｂ． Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＭＮ４ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ａＦＧＦ） ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＭＮ４ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａＦＧＦ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌ． ｌａｃｔｉｃ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ （ＤＳＳ）． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌ． ｌａｃｔｉｃ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｂｙ ｓｔｏｍａｃｈ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ Uｌｃｅｒａｔｉｖｅ Cｏｌｉｔｉｓ（ＵＣ） ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｆｏｒ １７ ｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ． Ｓｏｍｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ， ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｓｔｏｏｌ， ｃｏｌｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＭＰＯ） ｉｎ ｕｌｃｅｒａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａＦＧＦ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ５０ μｇ／ｍＬ； ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌ． ｌａｃｔｉｃ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ， ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｓｔｏｏｌ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ， ｋｅｅｐ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎ， ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＭＰＯ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌ． ｌａｃｔｉｃ ｃｏｕｌｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＣ， ａｎｄ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｎｅｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ； hｕｍａｎ ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ

潰瘍性結(jié)腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）［１］又稱非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種原因不明的直腸和結(jié)腸炎性疾病，普遍結(jié)論認(rèn)為是環(huán)境、遺傳、免疫、心理及感染等多種因素共同影響的結(jié)果。病變主要累及大腸黏膜及黏膜下層，范圍多自遠(yuǎn)端結(jié)腸開始，可逆行向近端發(fā)展，甚至累及全結(jié)腸及末段回腸，呈連續(xù)性分布，由于反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，給患者身心帶來不適。

酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ａＦＧＦ）是成纖維細(xì)胞因子家族中的基本成員，是一類對(duì)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種類型細(xì)胞具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子［２］。ａＦＧＦ包括促分裂活性與非促分裂激素樣活性，其中促分裂活性主要包括促血管生成、組織發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用；而非促分裂激素樣活性則主要有抑制細(xì)胞凋亡、降低血壓、調(diào)節(jié)細(xì)胞Ｃａ２＋平衡、促激素分泌和參與中樞反饋調(diào)節(jié)［３，４］。

在前期研究的基礎(chǔ)上，采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建人ａＦＧＦ轉(zhuǎn)基因乳酸菌并制成活菌制劑，開展重組ａＦＧＦ乳酸菌對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防和治療作用研究，為實(shí)現(xiàn)ａＦＧＦ口服給藥治療消化道潰瘍奠定前期試驗(yàn)基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１質(zhì)粒與試劑載體ｐＭＧ３６ｅ、乳酸菌ＭＧ１３６３、植物乳桿菌、Ｅ．ｃｏｉｌ ＪＭ１０９ 由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室保存，乳酸菌ＮＺ９７００購(gòu)自荷蘭ＮＩＣＯ公司。質(zhì)粒小體提取試劑盒、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技北京有限公司。限制性內(nèi)切酶ＳｐｈⅠ，ＳａｃⅠ，ＮｃｏⅠ，ＸｈｏⅠ，ＨｐａⅠ購(gòu)自ＴａＫａＲａ公司，ＥａｒⅠ購(gòu)自ＮＥＢ公司。鼠抗人ａＦＧＦ抗體購(gòu)自Ｒ＆Ｄ公司，羊抗鼠二抗購(gòu)自廣州碧云天公司。ＰＶＤＦ膜購(gòu)自Ｐａｌｌ公司。ＤＳＳ購(gòu)于上海西寶生物制劑公司，相對(duì)分子量為５ ０００，用生理鹽水配制成５％的溶液。ＳＡＳＰ購(gòu)于上海三維制藥有限公司，批號(hào)２０１００７１２。髓過氧化物酶（ＭＰＯ）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

１．１．２培養(yǎng)基ＬＢ培養(yǎng)基（１ ０００ ｍＬ）：蛋白胨１０ ｇ，酵母浸出粉５ ｇ，氯化鈉１０ ｇ（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉１２ ｇ）；ＧＭ１７培養(yǎng)基（１ ０００ ｍＬ）：Ｍ１７培養(yǎng)基３７．２５ ｇ，葡萄糖５ ｇ（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉１２ ｇ）；ＢＣＰ培養(yǎng)基（１ ０００ ｍＬ）：蛋白胨２０ ｇ，酵母粉５ ｇ，氯化鈉４ ｇ，乙酸鈉１．５ ｇ，溴甲酚紫４０ ｍｇ，蜜二糖５ ｇ（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉１２ ｇ）。

１．１．３實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，８周齡，體重（２０±２）ｇ／只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

１．２方法

１．２．１重組人ａＦＧＦ乳酸菌的構(gòu)建及表達(dá)首先從植物乳桿菌基因組中擴(kuò)增出半乳糖苷酶基因（ｍｅｌＡ）片段，用ＳｐｈⅠ和ＳａｃⅠ雙酶切后，與穿梭質(zhì)粒ｐＭＧ３６ｅ連接構(gòu)成質(zhì)粒ｐＧＭＮ１；再與從乳酸菌質(zhì)粒ｐＮＺ８０４８擴(kuò)增出來的Ｐｎｉｓ－ＭＣＳ段基因連接，構(gòu)成質(zhì)粒ｐＧＭＮ２；將人工合成的乳酸菌密碼子偏好型的ＵＳＰ４５－ＬＥＩＳＳ－ａＦＧＦ１４－１５４基因片段用ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切后，與質(zhì)粒ｐＧＭＮ２連接，構(gòu)成質(zhì)粒ｐＧＭＮ３；用限制性內(nèi)切酶ＨｐａⅠ敲除紅霉素抗性基因后，構(gòu)成在乳酸菌中表達(dá)ａＦＧＦ的質(zhì)粒ｐＧＭＮ４，并將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至乳酸菌ＮＺ９７００菌株中，ＰＣＲ篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接ＧＭ１７培養(yǎng)基。厭氧培養(yǎng)４８ｈ后，離心收集菌體上清，ＴＣＡ沉淀濃縮上清總蛋白，經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析篩選出高效表達(dá)ａＦＧＦ的菌株，ＥＬＩＳＡ試劑盒測(cè)定上清中ａＦＧＦ含量。

１．２．２重組ａＦＧＦ乳酸菌制劑對(duì)小鼠ＤＳＳ誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防和治療作用

１）實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)共分７個(gè)組，各組小鼠均為１０只，分別為正常組（Ｎ）：正常采食，飲水１７ ｄ；模型組 （Ｍ）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋無菌生理鹽水灌胃17 ｄ；柳氮磺砒啶組（ＳＡＳＰ）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋ ＳＡＳＰ （０．５ｇ／ｋｇ）灌胃１7 ｄ；ａＦＧＦ乳酸菌高劑量組（ａＦＧＦ－Ｈ）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋乳酸菌ＮＺ９７００（ｐＧＭＮ４－ＵＳＰ４５－ＬＥＩＳＳ－ａＦＧＦ１４－１５４）高劑量菌液灌胃１７ ｄ；ａＦＧＦ乳酸菌中劑量組（ａＦＧＦ－Ｍ）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋乳酸菌ＮＺ９７００（ｐＧＭＮ４－ＵＳＰ４５－ＬＥＩＳＳ－ａＦＧＦ１４－１５４）中劑量菌液灌胃１７ ｄ；ａＦＧＦ乳酸菌低劑量組（ａＦＧＦ－Ｌ）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋乳酸菌ＮＺ９７００（ｐＧＭＮ４－ＵＳＰ４５－ＬＥＩＳＳ－ａＦＧＦ１４－１５４）低劑量菌液灌胃１７ ｄ；乳酸菌組（ＮＺ９７００）：５％ ＤＳＳ自由飲用７ ｄ造模＋乳酸菌 ＮＺ９７００菌液灌胃１７ ｄ。每只小鼠一次灌胃量為２００ μＬ。

２）每天觀察比較小鼠的一般情況，包括體重、精神狀態(tài)、毛色、活動(dòng)、大便性狀，參照表１計(jì)算ＤＡＩ積分。

３）樣品收集。于實(shí)驗(yàn)第１７天，脫臼斷髓處死小鼠，取出肛門至盲腸末端的整個(gè)結(jié)腸和直腸段，觀察結(jié)腸的大體改變，測(cè)量整個(gè)結(jié)腸長(zhǎng)度。用預(yù)冷無菌生理鹽水將結(jié)腸沖洗干凈，分別于結(jié)腸末端（距肛門１ ｃｍ）處剪取０．５ ｃｍ結(jié)腸段，４％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，ＨＥ染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。另各取遠(yuǎn)段、中段、近段結(jié)腸、盲腸組織約５０ ｍｇ迅速冷凍于液氮中，后轉(zhuǎn)至－８０ ℃保存，用以檢測(cè)髓過氧化物酶（ＭＰＯ）的活性。

２結(jié)果

２．１重組人ａＦＧＦ乳酸菌的構(gòu)建及表達(dá)

２．１．１重組人ａＦＧＦ乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定以來自乳酸菌表達(dá)載體ｐＮＺ８０４８的Ｐｎｉｓ啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)序列（Ｐｎｉｓ－ＭＣＳ）為構(gòu)建乳酸表達(dá)菌所用啟動(dòng)子，以植物乳桿菌半乳糖苷酶基因（ｍｅｌＡ）為篩選標(biāo)記，經(jīng)過一系列酶切和連接反應(yīng)，構(gòu)建表達(dá)ａＦＧＦ的乳酸菌表達(dá)載體ｐＧＭＮ４。對(duì)構(gòu)建好的ｐＧＭＮ４進(jìn)行雙酶切鑒定，得到預(yù)期大小的目的片段５４５ ｂｐ（圖１），同時(shí)對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，比對(duì)結(jié)果表明ＤＮＡ序列與源序列完全匹配。

２．１．２重組人ａＦＧＦ乳酸菌的篩選及表達(dá)重組表達(dá)載體ｐＧＭＮ４電擊轉(zhuǎn)化乳酸菌ＮＺ９７００中，以重組質(zhì)粒ｐＧＭＮ４為陽性對(duì)照，以水為陰性對(duì)照，ＰＣＲ擴(kuò)增篩選陽性克隆，結(jié)果如圖２所示，Ａ１～Ａ１０均為陽性克隆。將陽性克隆接種培養(yǎng)，１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Bｌｏｔ分析結(jié)果表明已成功篩選出高表達(dá)ａＦＧＦ的乳酸菌菌株（圖３）。ＥＬＩＳＡ檢測(cè)上清中ａＦＧＦ含量為５０ μｇ／ｍＬ。

２．２重組ａＦＧＦ乳酸菌制劑對(duì)小鼠ＤＳＳ誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的治療試驗(yàn)結(jié)果

２．２．１體重變化小鼠每日體重變化見表２和圖４。由表２和圖４可見，Ｍ組、ａＦＧＦ－Ｌ組和ＮＺ９７００組小鼠體重在６～７ ｄ較正常組極顯著下降（Ｐ＜０．０１）；ＳＡＳＰ組和ａＦＧＦ－Ｈ組、ａＦＧＦ－Ｍ組體重變化輕微，但與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＜０．０１）。

２．２．２小鼠的一般情況和ＤＡＩ值經(jīng)觀察，模型組小鼠毛色暗淡，惡動(dòng)，精神狀態(tài)不佳。在飲用ＤＳＳ后３～５ ｄ出現(xiàn)腹瀉，５～１０ ｄ出現(xiàn)不同程度的肉眼血便。而ＳＡＳＰ組和ａＦＧＦ－Ｈ組、ａＦＧＦ－Ｍ組小鼠毛色光亮，喜動(dòng)，精神狀態(tài)良好。在飲用ＤＳＳ后３～５ ｄ出現(xiàn)腹瀉，肉眼血便次數(shù)和量明顯減少，部分動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)過程中未見血便，體重變化如上（表２和圖４）所示。ＤＡＩ評(píng)分在正常組為０；在試驗(yàn)的第１７天，對(duì)比ＤＳＳ模型組，ＳＡＳＰ陽性藥物組和ａＦＧＦ－Ｈ處理組ＤＡＩ值顯著下降（差異水平分別為Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５），而ＳＡＳＰ陽性藥物組和ａＦＧＦ－Ｈ處理組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同劑量ａＦＧＦ乳酸菌處理組間未見明顯劑量依賴關(guān)系（表３）。

２．２．３小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度變化ＤＳＳ造模組（M組）小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較Ｎ組顯著縮短（Ｐ＜０．０１）；ＳＡＳＰ組、ａＦＧＦ－Ｈ組和ＮＺ９７００乳酸菌液處理組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度相對(duì)于DSS造模組（M組）有不同程度的改善，以ＳＡＳＰ組、ａＦＧＦ－Ｈ乳酸菌液處理組的效果較為顯著（Ｐ＜０．０１），兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ａＦＧＦ乳酸菌３個(gè)劑量處理組中，僅高劑量組顯示有改善效果（圖５）。

２．２．４小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化大體病理改變：肉眼可見正常小鼠結(jié)腸黏膜完整，薄而光滑，有一定透明度；模型組小鼠結(jié)腸黏膜普遍水腫、糜爛、潰瘍、附著偽膜，并覆蓋有連結(jié)成片的膿苔。鏡下組織病理改變：正常組小鼠結(jié)腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細(xì)胞無減少，未見黏膜糜爛、出血；模型組小鼠結(jié)腸潰瘍病變部位可見部分隱窩破壞變形，淋巴組織增生，腸壁各層中血管普遍擴(kuò)張充血，腺體排列紊亂，杯狀細(xì)胞減少，小腸腔內(nèi)可見炎性分泌滲出物，其中含纖維素、漿細(xì)胞、紅細(xì)胞等；ＳＡＳＰ組和ａＦＧＦ－Ｈ乳酸菌液處理組黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少，有輕微的充血現(xiàn)象；ａＦＧＦ－Ｍ乳酸菌液處理組黏膜組織結(jié)構(gòu)尚完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，小血管充血較明顯；ａＦＧＦ－Ｌ乳酸菌液處理組和ＮＺ９７００處理組黏膜組織結(jié)構(gòu)不完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)多，充血明顯，可見炎性分泌滲出物（圖６）。

３．５小鼠結(jié)腸組織髓過氧化物酶（ＭＰＯ）的檢測(cè)

測(cè)定組織ＭＰＯ活性，作為評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的指標(biāo)，依照南京建成ＭＰＯ試劑盒操作說明處理樣品，在４６０ ｎｍ處測(cè)光密度（ＯＤ）值，以獲取該組織樣品的ＭＰＯ活性。由圖７可見，ＳＡＳＰ組和ａＦＧＦ－Ｈ乳酸菌液處理組能夠顯著降低ＭＰＯ活性，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（差異水平分別為Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５），而ＳＡＳＰ陽性藥物組和ａＦＧＦ－Ｈ處理組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

３討論

ＵＣ是一種原因不明的腸道慢性非特異性炎癥，對(duì)其治療必須是快速而有效的。傳統(tǒng)的治療藥物包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、別嘌呤硫醇、甲氨蝶呤和抗腫瘤壞死因子等，而這些藥物在臨床應(yīng)用上都會(huì)存在不恰當(dāng)用藥的誤區(qū)，給病人帶來不同程度的副作用，因此優(yōu)化治療方案和開發(fā)安全有效的藥物非常重要［５］。在ＵＣ的發(fā)病過程中，腸道微環(huán)境的破壞是重要的環(huán)節(jié)之一，而作為維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的益生菌也因此被應(yīng)用到ＵＣ的預(yù)防和治療上。Ｈｅｒｉａｓ等［６］發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用乳酸桿菌并不能有效地阻止ＤＳＳ誘發(fā)的小鼠ＵＣ，只能部分改善臨床整體狀況，而益生菌的聯(lián)合應(yīng)用則是今后治療的發(fā)展方向。乳酸桿菌和丁酸梭菌聯(lián)用可能通過抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，從而加速受損傷上皮層的修復(fù)，降低上皮層的通透性，達(dá)到治療ＵＣ的有效作用［７］。

乳酸菌也是繼大腸桿菌以及酵母菌之后又一具有實(shí)用價(jià)值的表達(dá)系統(tǒng)，開創(chuàng)了口服疫苗的新前景。乳酸菌作為表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于安全、無內(nèi)毒素，表達(dá)的外源蛋白不用經(jīng)過純化即可直接連菌體一起服用，同時(shí)可以在腸道中存活定殖，持續(xù)表達(dá)外源靶蛋白［８］。因此，本研究把乳酸菌作為表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建人ａＦＧＦ轉(zhuǎn)基因乳酸菌，探討其對(duì)ＤＳＳ誘導(dǎo)的ＵＣ的預(yù)防和治療作用。ＵＣ的愈合與局部組織中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ＦＧＦ）水平升高相關(guān)，而ＦＧＦ通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)新生血管生成發(fā)揮作用［９，１０］。口服ａＦＧＦ蛋白藥物經(jīng)胃腸道后存在酶解現(xiàn)象，半衰期短，而重組ａＦＧＦ乳酸菌可以避免胃腸道的酶解問題，并且可以在體內(nèi)增殖，從而可以持續(xù)不斷地表達(dá)ａＦＧＦ蛋白，促進(jìn)潰瘍愈合。與此相符，該試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量活菌制劑對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有很好的預(yù)防和治療效果，表現(xiàn)為改善小鼠的一般情況和潰瘍導(dǎo)致的結(jié)腸縮短狀況，促進(jìn)組織修復(fù)，保持結(jié)腸結(jié)構(gòu)的完整性。此外，有研究表明［１１］，ＦＧＦ能夠顯著降低ＩＬ－１β的分泌，有效改善局部炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)中，ａＦＧＦ乳酸菌能夠顯著降低潰瘍結(jié)腸組織中的ＭＰＯ活性，與病理形態(tài)學(xué)結(jié)果中減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的效果是一致的，提示ａＦＧＦ乳酸菌治療ＵＣ與其抗炎效應(yīng)相關(guān)。重組ａＦＧＦ乳酸菌對(duì)小鼠ＵＣ具有良好的預(yù)防和治療效果，將為ＵＣ治療制劑的開發(fā)提供更加廣闊的思路。

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