新城疫病毒TS09耐熱株HＮ基因的序列測(cè)定與分析

摘要：新城疫病毒ＴＳ０９耐熱株是由Ｖ４株經(jīng)耐熱選育得到的新毒株。對(duì)其血凝素－神經(jīng)氨酸酶（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＨＮ）基因進(jìn)行序列測(cè)定分析。選取ＧｅｎBａｎｋ中國(guó)內(nèi)外具有代表性的序列與其進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，氨基酸序列同源性比較中，ＴＳ０９耐熱株與Ｖ４株的氨基酸的同源性為９６．８％；在核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，Ｖ４株位于基因Ｉ型的分支上，ＴＳ０９耐熱株位于基因ＩＩ型的分支上；耐熱株中ＨＮ基因中ＧＣ含量為４７．５８％，比不耐熱株ＧＣ含量高；但比較耐熱株和不耐熱株ＨＮ蛋白的α螺旋，耐熱株比不耐熱株的ＨＮ蛋白在跨膜區(qū)和胞外區(qū)均多出一個(gè)長(zhǎng)的α螺旋。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明ＴＳ０９耐熱株與Ｖ４株有很近的親緣關(guān)系；耐熱株和不耐熱株ＨＮ蛋白的ＧＣ含量、α－螺旋有很大的差別，這可能與耐熱性有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；ＴＳ０９耐熱株；ＨＮ基因；序列測(cè)定；耐熱分析

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２．６５＋９．５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）12－2543-03

Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＮ Gｅｎｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ ＴＳ０９

Hｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Sｔｒａｉｎ

ＳＨＡＮＧ Ｙｕ１，ＳＨＡＯ Ｈｕａ－ｂｉｎ２，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｌｉｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｕｎ２，ＨＵ Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｇｕｏ－ｆｕ１，ＷＥＮ Ｇｕｏ－ｙｕａｎ２

（１． Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｃａｄｅｍｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｉｎｓｉｔｕｄｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs， Ｗｕｈａｎ ４３０２０９， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｉｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｂｙ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ． Ｉｔｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ-ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ （ＨＮ） ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ． Dｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎBａｎｋ were selected ｔｏ ａｎａｌｙze ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙｌｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＮ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ９６．８％ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｇｅｎｅｔｙｐｅ ＩＩ ａｎｄ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｇｅｎｅｔｙｐｅ Ｉ． Ｔｈｅ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ＨＮ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ４７．５８％ ｔｈａｔ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｔｈｅ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｖｅ ｔｗｏ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ，ｏｎｅ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ａｒｅ ｖｅｒｙ ｃｌｏｓｅ． ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｏｆ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｅ ｖｅｒｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ hｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ thermolabile ｓｔｒａｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ representate ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ； ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； ＨＮ ｇｅｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ； ｔｈｅｒｍａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）是由新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）引起的禽類急性烈性傳染性疾病，每年給國(guó)內(nèi)外的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ＮＤＶ屬于副黏病毒科腮腺炎病毒屬，其基因組有１５ １８６、１５ １９２和１５ １９８?jìng)€(gè)核苷酸三種長(zhǎng)度［１，２］，有六個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，編碼６個(gè)主要蛋白（即ＮＰ核蛋白，Ｐ磷蛋白，Ｍ基質(zhì)蛋白，Ｆ融合蛋白，ＨＮ血凝素－神經(jīng)氨酸酶和Ｌ聚合酶）［３］。Ｆ蛋白和ＨＮ蛋白是ＮＤＶ的兩種囊膜糖蛋白，它們與ＮＤＶ的致病性和免疫原性密切相關(guān)。ＨＮ蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，在ＮＤＶ侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，ＨＮ蛋白能識(shí)別、吸附受體，并且能促進(jìn)Ｆ蛋白與胞膜的融合。在不同的毒株中，ＨＮ基因的長(zhǎng)度大小不一，其長(zhǎng)度范圍在１ ７１６～１ ８５１ ｎｔ，編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度也隨之變化。

新城疫在我國(guó)屬于強(qiáng)制性免疫疫病。目前，市場(chǎng)上使用的疫苗有活疫苗和滅活疫苗兩種，活疫苗包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗。這些疫苗各有缺點(diǎn)：中等毒力株活疫苗有較強(qiáng)的毒副反應(yīng)，且有出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)［４］；低毒力活疫苗冷藏條件要求高，常因保存或使用不當(dāng)而影響疫苗免疫效果；滅活疫苗需要肌肉注射，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，免疫成本高，且影響禽肉品質(zhì)。因此，研制無(wú)毒耐熱活疫苗在防控新城疫方面有很重要的意義。ＮＤＶ Ｖ４株是澳大利亞學(xué)者Ｓｉｍｍｏｎｓ從８周齡有潰瘍的雞腺胃中分離的１株自然無(wú)毒耐熱毒株，１９８８年，我國(guó)從澳大利亞引進(jìn)該毒株，并對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明引進(jìn)的Ｖ４株免疫雞群后，ＨＡ抗體水平十分不一致，因而影響免疫雞群的保護(hù)率。隨后國(guó)內(nèi)一些學(xué)者結(jié)合我國(guó)的實(shí)際進(jìn)行了多方面的研究，并培育篩選出新的克隆株［５－７］。

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所于１９８９年引入該株，并對(duì)其進(jìn)行了耐熱選育，獲得了１株新的耐熱疫苗株ＴＳ０９株。經(jīng)耐熱試驗(yàn)分析（數(shù)據(jù)未列出），該毒株的耐熱性比親本株更好，且其保持原有的無(wú)毒力。該研究對(duì)ＴＳ０９耐熱株的ＨＮ基因進(jìn)行了序列測(cè)定，分析了其與Ｖ４株的進(jìn)化關(guān)系，并從蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)與耐熱性的關(guān)系角度探討了其可能的耐熱機(jī)制，為尋找ＮＤＶ耐熱株的耐熱因子提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１毒株

ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所對(duì)ＮＤＶ Ｖ４株經(jīng)耐熱選育后獲得，為雞胚尿囊液，雞胚半數(shù)感染劑量（ＥＩＤ５０）為１×１０９．７／ｍＬ。

１．２試劑

主要儀器和試劑：ＰＴ－２０００ ＰＣＲ儀、Ｍｏｄｅｌ ３０００Ｘｉ電泳儀購(gòu)自ＢｉｏＢＡＤ公司；Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、瓊脂糖購(gòu)自ＯＭＥＧＡ公司；Ｔｒｉｚｏｌ裂解液購(gòu)自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｍ－ＭＬＶ反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物購(gòu)自上海寶生物公司；Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（５０）購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；氯仿等試劑為分析純?cè)噭?/p>

１．３引物設(shè)計(jì)

參考Ｇｅｎｂａｎｋ上與ＮＤＶ Ｖ４株ＨＮ基因相似度最高的序列（序列號(hào)為ＡＹ９３５４９３），設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物。兩條擴(kuò)增片段之間有７２ ｎｔ的重疊區(qū)，覆蓋了整個(gè)ＨＮ基因區(qū)域以及其上游下游部分序列。兩對(duì)引物的序列為：

Ｆ１：５′－ＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＧ－３′

Ｒ１：５′－ＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣ－３′

Ｆ２：５′－ＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧ－３′

Ｒ２：５′－ＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣ－３′

由上海博尚生物有限公司合成。

１．４病毒ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成

根據(jù)ＲＮＡ提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒全基因組ＲＮＡ。病毒ＲＮＡ樣品用４０ μＬ的ＤＥＰＣ水溶解。取１７ μＬ ＲＮＡ樣品和１ μＬ隨機(jī)引物在７０ ℃水浴５ ｍｉｎ，立即冰浴；加入５ μＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ，１．５ μＬ ｄＮＴＰｓ，０．５ μＬ Ｍ－ＭＬＶ，混勻后４２ ℃ ６０ ｍｉｎ；９５ ℃ ５ ｍｉｎ；冰浴，待進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。

１．５ＰＣＲ擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

取１ μＬ ｃＤＮＡ作為模板進(jìn)行ＨＮ基因的ＰＣＲ擴(kuò)增。ＰＣＲ體系為：５ μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋），１ μＬ ｄＮＴＰｓ，１ μＬ上游引物，１ μＬ下游引物，１ μＬ模板，０．５ μＬ Ｔａｑ酶，４０．５ μＬ Ｈ２Ｏ；ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９５ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ，５２℃ ４５ ｓ，７２ ℃ ２ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物以１％瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后，切下目的片段，用Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ純化回收ＤＮＡ。

１．６序列測(cè)定與分析

純化的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)ＴＳ０９株以及由Ｇｅｎｂａｎｋ（美國(guó)國(guó)家生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，ＮＣＢＩ）檢索獲得到的２５株ＮＤＶ ＨＮ基因序列（其具體信息見(jiàn)表１）進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。氨基酸同源性分析采用ＤＮＡｓｔａｒ軟件包中的Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序。遺傳進(jìn)化分析采用ＭＥＧＡ４軟件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ，４．０版本），具體參數(shù)設(shè)置參照文獻(xiàn)［１２］進(jìn)行。

２結(jié)果

２．１ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株ＨＮ基因的擴(kuò)增

分別以引物對(duì)（Ｆ１；Ｒ１）、（Ｆ２；Ｒ２）擴(kuò)增出１號(hào)和２號(hào)片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖１，由圖１可得，兩條目的條帶均在２ ０００ ｂｐ左右，與預(yù)期的大小（１號(hào)２ ０８５ ｂｐ和２號(hào)２ ０９５ ｂｐ）相符。

２．２ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株ＨＮ基因序列測(cè)定

對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行純化及序列測(cè)定后，將兩條序列進(jìn)行拼接，獲得ＮＤＶ ＴＳ０９株ＨＮ基因的全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)為１ ７３４ ｎｔ，編碼由５７７個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為６２．８ ｋＤ，等電點(diǎn)為６．６４。

２．３ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株ＨＮ基因的氨基酸同源性分析

應(yīng)用ＤＮＡｓｔａｒ軟件包中的Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序，對(duì)包括ＴＳ０９耐熱株在內(nèi)的２６株ＮＤＶ ＨＮ基因進(jìn)行氨基酸同源性分析。結(jié)果表明，ＴＳ０９耐熱株與其余２５株ＮＤＶ ＨＮ蛋白的氨基酸同源性為８７．６％～９６．８％。ＴＳ０９株與Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ株的同源性最高，均為９６．８％；與ＨＢ９２株的同源性為９６．７％。

２．４基于ＨＮ基因的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用ＭＥＧＡ４軟件，對(duì)包括ＴＳ０９耐熱株在內(nèi)的２６株ＮＤＶ ＨＮ基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，得到圖２。由圖２可得，２６個(gè)ＮＤＶ毒株依據(jù)其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可分為７個(gè)基因型。毒株的基因分型結(jié)果與表１中所描述的分型結(jié)果一致，表明進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建成功。分析ＴＳ０９耐熱株與其親本Ｖ４株的親緣關(guān)系：Ｖ４株屬于基因Ｉ型，而ＴＳ０９耐熱株則位于基因ＩＩ型的單獨(dú)一個(gè)分支上，與Ｌａｓｏｔａ、Ｂ１等ＩＩ型代表株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期耐熱選育，ＴＳ０９耐熱株已經(jīng)由原有的基因Ｉ型進(jìn)化為基因ＩＩ型。

２．５ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株ＨＮ基因以及蛋白質(zhì)α螺旋分析

比較４株ＮＤＶ耐熱株（ＴＳ０９、Ｉ－２、Ｉ－２ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ和Ｖ４）和４株非耐熱毒株（Ｃｌｏｎｅ３０、Ｌａｓｏｔａ、Ｂ１和Ｍｅｘｉｃｏ）ＨＮ基因ＧＣ含量和疏水性氨基酸含量，結(jié)果顯示耐熱毒株ＧＣ含量明顯比不耐熱毒株高（表２）。

比較上述８株ＮＤＶ毒株的ＨＮ蛋白α螺旋時(shí)發(fā)現(xiàn)，耐熱毒株ＨＮ蛋白在跨膜區(qū)域里面有一個(gè)較長(zhǎng)的α螺旋（位置大約在３９－５１氨基酸），而不耐熱株沒(méi)有或很短；耐熱株ＨＮ蛋白在胞外區(qū)（２８０－２９８氨基酸區(qū)）有一個(gè)大的α螺旋（ＴＳ０９株除外），而不耐熱株在這個(gè)區(qū)域只有一個(gè)或兩個(gè)較小的α螺旋（圖３）。

３討論

ＮＤＶ ＨＮ蛋白是一種跨膜蛋白，ＨＮ蛋白的主要疏水區(qū)在Ｎ端，１～２６氨基酸殘基為囊膜內(nèi)區(qū)，２７～４８氨基酸殘基是跨膜區(qū)，其余為膜外區(qū)。ＴＳ０９耐熱株與其他２６株ＨＮ蛋白氨基酸序列同源性為８７．６％～９６．８％，與Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ和ＨＢ９２株同源性較高（達(dá)９６．７％以上），這在一定程度上表明ＴＳ０９耐熱株與Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ和ＨＢ９２株有一定的親緣關(guān)系。有研究表明，ＨＮ蛋白的差異主要集中在１～８０氨基酸上，８１位以后變異相對(duì)較少［８］，因此前８０位氨基酸的相似性可以很大程度上說(shuō)明毒株之間的親緣關(guān)系。在比較ＴＳ０９耐熱株ＨＮ蛋白前８０個(gè)氨基酸與其他毒株的相似性時(shí)發(fā)現(xiàn)，ＴＳ０９株ＨＮ蛋白前８０個(gè)氨基酸與Ｖ４株ＨＮ蛋白前８０個(gè)氨基酸的相似性達(dá)到１００％（其他數(shù)據(jù)未列出）。這進(jìn)一步證實(shí)了ＴＳ０９耐熱株與Ｖ４株具有較近的親緣關(guān)系。在基于ＨＮ基因的遺傳進(jìn)化分析中，由Ｖ４株選育得來(lái)的ＨＢ９２株和ＴＳ０９耐熱株位于同一分支上（ＩＩ型），而Ｖ４株卻在Ｉ型的分支上。由此表明，在耐熱選育的過(guò)程中，ＨＮ蛋白存在一定程度的變異，其基因型也隨之發(fā)生由Ｉ型到ＩＩ型的改變。在ＩＩ型的分支中ＴＳ０９耐熱株有單獨(dú)在一分支上，而ＨＢ９２和Ｃｌｏｎｅ３０、ＬａＳｏｔａ、Ｂ１株位于另一分支上。

ＴＳ０９耐熱株ＨＮ基因長(zhǎng)１ ７３４ ｂｐ，編碼５７７個(gè)氨基酸，而Ｖ４株ＨＮ基因長(zhǎng)１ ８５１ ｂｐ，編碼６１６個(gè)氨基酸。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，缺失的長(zhǎng)度全部在ＨＮ蛋白的末端，也就是膜外區(qū)的末端。這可能是由于選育壓力導(dǎo)致的，ＨＮ蛋白暴露在膜外的部分較大，末端的部分缺失可以減小蛋白在膜外的體積，使其結(jié)構(gòu)更趨穩(wěn)定，這大概是ＴＳ０９耐熱株比Ｖ４株耐熱性更好的原因。有學(xué)者認(rèn)為ＨＮ蛋白對(duì)耐熱沒(méi)有太大作用［９］，但我們的耐熱試驗(yàn)結(jié)果表明，ＴＳ０９耐熱株和Ｖ４株在５６℃水浴中溫育２ ｈ后，依舊具有一定的血凝活性，而對(duì)照Ｌａｓｏｔａ株則完全喪失血凝活性，表明ＴＳ０９耐熱株和Ｖ４株ＨＮ蛋白具有耐熱性。

研究表明部分疏水性氨基酸隨ＧＣ含量增加而增加［１０］，疏水性氨基酸的增加可以增加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)緊密性，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更趨向穩(wěn)定［１１］。比較耐熱株和非耐熱株時(shí)發(fā)現(xiàn)前者ＧＣ含量顯著高于后者，但統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得到疏水性氨基酸含量并不與ＧＣ含量呈正相關(guān)。可見(jiàn)，ＨＮ蛋白的耐熱性增加并不依賴于疏水性氨基酸的增加，ＧＣ含量的增加，可能是通過(guò)其他途徑增加ＨＮ的耐熱性。在分析ＨＮ蛋白中的α螺旋時(shí)發(fā)現(xiàn)，耐熱株普遍比不耐熱株多兩個(gè)長(zhǎng)的α螺旋，其中一個(gè)在跨膜區(qū)，這可能促進(jìn)跨膜區(qū)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，有利于蛋白鑲嵌在膜上，從而促進(jìn)耐熱；另一個(gè)在胞外區(qū)，這可以促進(jìn)胞外區(qū)的蛋白的穩(wěn)定，有利于維護(hù)蛋白的空間構(gòu)象，保護(hù)功能區(qū)不受破壞，從而增加了ＨＮ蛋白的耐熱能力。

綜上所述，由氨基酸同源性分析可知ＴＳ０９耐熱株與親本Ｖ４株又很近的親緣關(guān)系，但進(jìn)化樹(shù)分析表明兩株之間存在一定的變異。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)耐熱株和非耐熱株ＨＮ蛋白α螺旋存在一定的差異，這可能是ＨＮ蛋白耐熱的部分因素。但病毒的耐熱的機(jī)制是很復(fù)雜的，不但與核酸和蛋白質(zhì)的組成以及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用等因素有關(guān)。該研究的后期工作是對(duì)ＮＤＶ ＴＳ０９耐熱株的全基因組進(jìn)行測(cè)定，從全基因組的角度分析耐熱毒株和不耐熱毒株之間的差異，進(jìn)一步推動(dòng)病毒耐熱機(jī)制的研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＡＬＩＺ ＣＺＥＧＬＥＤＩ，ＤＯＲＩＮＡ ＵＪＶＡＲＩ，ＥＳＺＴＥＲ ＳＯＭＯＧＹＩ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ ｃａｔｅｇｏｒｙ ｏｆ ａｖｉａｎ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ） ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１２０：３６-４８．

［２］ ＨＵＡＮＧ Ｙ，ＷＡＮ Ｈ Ｑ，ＬＩＵ Ｈ Ｑ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｇｅｅｓｅ： ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｘ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ， ２００４，１４９： １４４５-１４５７．

［３］ 黃勇，萬(wàn)洪全，劉紅旗，等． 鵝源新城疫病毒 ＺＪ１ 株全基因組的序列測(cè)定［Ｊ］． 病毒學(xué)報(bào)，２００３，１９（４）：３４８－３５４

［４］ 仇旭升，孫慶，姚春峰，等． 兩株基因Ⅲ型強(qiáng)毒新城疫的全基因組測(cè)序及其與Ⅰ系苗的關(guān)系［Ｊ］． 微生物學(xué)報(bào)，２００９，４９（３）：３０２－３０８．

［５］ 邵華斌，楊峻，熊忠良，等． 雞新城疫Ｖ４克隆株疫苗研究與應(yīng)用 Ｉ－Ｖ４克隆株／ＨＢ９２株選育及生物學(xué)特性測(cè)定［Ｊ］． 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００４（５）：８２－８４．

［６］ 邵華斌，黎秋華，楊峻． 雞新城疫病毒ＨＢ９２株生物學(xué)特性的研究——對(duì)鴿和鵪鶉的免疫性試驗(yàn)［Ｊ］． 湖北畜牧獸醫(yī)，１９９６（１）：４－５．

［７］ 黎秋華，邵華斌，楊峻． 雞新城疫病毒ＨＢ９２株生物學(xué)特性研究（ＩＩ）——對(duì)熱的穩(wěn)定性及在雞群中的自然傳播性試驗(yàn)［Ｊ］． 湖北畜牧獸醫(yī)，１９９６（２）：４５－５２．

［８］ 秦卓明，王友令，馬保臣，等．新城疫病毒ＨＮ基因的遺傳變異與ＨＩ相關(guān)性的研究［Ｊ］．病毒學(xué)報(bào)，２００６，２２（５）：３７９－３８4．

［９］ ＫＡＴＴＥＮＢＥＬＴ Ｊ Ａ，ＭＥＥＲＳ Ｊ，ＧＯＵＬＤ Ａ Ｒ． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ｓｔｒａｉｎ Ｉ－２） ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｌｏｃｕｓ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６， １１４：１３４－１４１．

［１０］ 朱蔚，鄭佐華，袁有忠，等． 編碼序列的（Ｇ＋Ｃ）％與蛋白質(zhì)的耐熱性相關(guān)性分析［Ｊ］．遺傳學(xué)報(bào)，１９９９，２６（４）：４１８－４２７．

［１１］ 丁彥蕊，蔡宇杰，烏云，等．氨基酸的組成對(duì)蛋白質(zhì)耐熱性的影響［Ｊ］．生物技術(shù)，２００４，１４（４）：４７－５０．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文