JC-1單標法和JC-1/PI雙標法熒光探針檢測山羊附睪精子線粒體膜功能的研究

摘要：為準確、全面研究超低溫冷凍技術對山羊附睪精子線粒體膜電位的影響效果，本試驗采用熒光探針ＪＣ－１單標和ＪＣ－１／ＰＩ雙標２種熒光染色方法，通過流式細胞儀和熒光顯微鏡兩種檢測手段對精子線粒體膜電位（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，MMP）變化進行檢測分析，用ＪＣ－１單獨染色，能準確、快速地區分高、低ＭＭＰ精子，但不能明確區分精子的存活狀態，采用ＪＣ－１與碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）雙標法，則能明顯判定精子的存活狀態。通過對絨山羊附睪精子在冷凍前和解凍后線粒體膜電位檢測，結果表明，單標記后高ＭＭＰ精子尾部呈橙紅色，低ＭＭＰ 精子尾部為綠色；雙標后死亡精子頭部呈紅色（ＰＩ＋）。對兩種檢測手段的比較研究，結果顯示，熒光顯微鏡能夠有效地區分出高、低ＭＭＰ 及死精子，但對于活精子中ＭＭＰ的高低檢測效果不理想；流式細胞儀則能夠有效地區分活精子ＭＭＰ 的高低，而且結果準確，速度快，敏感性高。試驗表明，兩種檢測方法相關性很高，分析同一處理樣品時用ＪＣ＋％和ＪＣ＋／ＰＩ－％檢測結果呈顯著正相關（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，Ｐ＜０．０１）。因此，對于精子線粒體ＭＭＰ 的分析，采用ＪＣ－１單染與ＪＣ－１／ＰＩ雙染的方法，利用流式細胞儀與熒光顯微鏡進行聯合檢測，能比較全面、準確的反映出精子線粒體的功能狀態。

關鍵詞：山羊；精子；線粒體膜電位；ＪＣ－１

中圖分類號：Ｓ８２７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2503-03

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏａｔ Ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ Ｓｐｅｒｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｙ ＪＣ－１ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ＪＣ－１／ＰＩ Ｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ

ＣＨＡＩ Ｊｕ１，ＧＡＯ Ｒｉ－ｍｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａ－ｘｉｎ１，ＭＥＮＧ Ｋｅ－ｇｅ－ｒｉ－ｌｅ１，ＷＡＮＧ Ｈｕｉ－ｍｅｉ３，ＺＨＡＯ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｉ－ｘｉｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ－ｇｕａｎｇ１，ＬＩ Ｊｉｎ－ｑｕａｎ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｏｈｈｏｔ ０１００18，Ｃｈｉｎａ；

２． The Spirit Ｊｉｎｙｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ.， Ltd.， Ｈｏｈｈｏｔ ０１００18，Ｃｈｉｎａ；

３． Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｓｈｉｇｕａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂａｏｔｏｕ ０１４０７０，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＪＣ－１ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （ＭＭＰ） ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－MMP ａｎｄ ｌｏｗ－ＭＭＰ ｓｐｅｒｍ ａｃｃｕｒａｔｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ， ｂｕｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ａｌｉｖｅ ｏｒ ｎｏｔ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｓ ｏｆ ＪＣ－１ ａｎｄ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ （ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｏａｔ ｆｒｅｓｈ ａｎｄ ｐｏｓｔ－ｔｈａｗ ｓｅｍｅｎ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｅｒｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｒｍｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｄｅａｄ ｓｐｅｒｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｗａｓ ｒｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｈｉｇｈ－ＭＭＰ ｓｐｅｒｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｗａｓ ｏｒａｎｇｅ， ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｏｆ ｌｏｗ ＭＭＰ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｓ ｗａｓ ｇｒｅｅｎ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅａｎｓ were ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｕｌｄ ｓｅｐａｒａｔｅ ｈｉｇｈ－MMP ａｎｄ ｌｏｗ－ＭＭＰ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＭＰ ｏｆ ｌｉｖｅ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｉｄｅａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＭＰ ｏｆ ｌｉｖｅ ｓｐｅｒｍ ａｃｃｕｒａｔｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｃｏｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，P＜0.01）． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔ ｒｅｆｌｅｃｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｏａｔ； ｓｐｅｒｍ； MMP； ＪＣ－１

線粒體是活性氧形成的主要場所，活性氧的生成是導致電子傳遞過程的中斷，氧化磷酸化與電子傳遞的耦合是維持高的線粒體膜電位（△ψｍ）的重要環節，而這種高的線粒體膜電位狀態是細胞和精子維持活性在線粒體中產生ＡＴＰ能量所必需的保障，因此，在精子整個代謝過程所需的能量主要由線粒體提供［１，２］。線粒體活性的改變會影響精子的能量供應［３］，且線粒體還是細胞凋亡的調控中樞［４］。因此，線粒體的功能狀態是精子功能質量的一個關鍵性指標。精子的線粒體上存在著跨膜電位，因此對線粒體活性的評價主要通過檢測線粒體的跨膜電位變化來分析。目前，檢測精子線粒體活性的熒光探針主要有羅丹明１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３，Ｒ１２３）、花青苷（Ｃｙａｎｉｎｅ）和５，５′，６，６′－四氯－１，１′，３，３′－四乙基苯并咪唑基-羰化青碘（５，５′，６，６′－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ－１，１′，３，３′-ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ－ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ，ＪＣ－１）等。ＪＣ－１是一種親脂性陽離子熒光染料，是檢測精子線粒體膜電位△ψｍ最理想的熒光探針，ＪＣ－１在檢測精子線粒體功能過程中，當線粒體膜電位△ψｍ高時，能承受逆轉運自由地穿過細胞膜，從單體形成聚合體，特異性地與線粒體內膜結合，當精子ＭＭＰ低時，以單體形式存在，發綠色熒光（５１０～５２０ ｎｍ）；當ＭＭＰ高時，形成二聚體，發橙色熒光［５］。而且ＪＣ－１染色的特異性好，僅在線粒體部位發橙色或綠色熒光。雖然單獨使用ＪＣ－１染色能判斷精子ＭＭＰ的高低，但不能準確地判斷精子的存活狀態。而碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）是一種死精子特異性熒光染料，能特異性地區分精子的狀態。當精子的質膜受損時，ＰＩ能進入精子內部與ＤＮＡ結合發出紅色熒光；而當精子質膜具有完整的功能時，ＰＩ不能進入精子內部，精子則不發熒光。目前檢測精子線粒體膜電位變化主要是使用熒光顯微鏡，這種方法可明確區分精子線粒體的高ＭＭＰ、低ＭＭＰ和死精子［６］，與流式細胞儀檢測效果相比，后者更準確、快速。報道在牛和人的精子檢測中曾用過這種方法，其他動物很少報道［７］。使用流式細胞儀可快速判定精子的狀態，在評價低溫精液冷凍保存以及凍精的受胎率等繁殖力指標效果是非常重要的，為此，本試驗采用ＪＣ－１單染與ＪＣ－１／ＰＩ雙染色法，分別使用流式細胞儀與熒光顯微鏡分析絨山羊精子的線粒體膜電位△ψｍ的變化，研究冷凍過程對山羊精子線粒體功能的影響效果。

１材料與方法

１．１主要試劑與儀器

Ｔｒｉｓ（三羥甲基氨基甲烷，Ｔ１５０３），Ｄ－（－）－果糖（Ｆ０１２７），檸檬酸（Ｃ２４０４），Ｄ－（＋）－葡萄糖，蔗糖（Ｓ０３３５，ＡＭＲＥＳＣＯ），檸檬酸鈉，青霉素，鏈霉素，ＪＣ－１（Ｃ２００６），ＰＩ（Ｐ４１７０），甘油（Ｇ６２７９）。以上試劑均購自Ｓｉｇｍａ公司。

冷凍細管（法國），流式細胞儀（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型，美國Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ公司），熒光顯微鏡（ＢＸ４１，ＯＬＹＰＵＳ），漩渦混合器（ＸＷ２８０Ａ型，上海醫科大學儀器廠），低速離心機（８００Ｂ型，上海安亭科學儀器廠），恒溫磁力攪拌器（７８ＨＷ－１型，杭州儀表電機廠），數顯電熱培養箱（ＨＰＸ－９０８２ＭＢＥ，上海博迅實業有限公司醫療設備廠），電熱恒溫水浴鍋（ＤＧＳＹ，北京市醫療設備廠），液氮容器（ＤＯＮＧＹＡ ＹＤＳ－３０，四川樂山市東亞機電工貿有限公司）。

１．２冷凍稀釋液配制

基礎稀釋液的配制：三羥甲基氨基甲烷３．０７ ｇ，果糖０．６３ ｇ，葡萄糖０．５ ｇ，蔗糖０．１３ ｇ，檸檬酸１．６４ ｇ， 卵黃１５ ｍＬ（新鮮的小雞蛋），甘油６ ｍＬ（Ｓｉｇｍａ），分別加入青霉素、鏈霉素各１０萬ＩＵ，用７９ ｍＬ去離子水溶解。溶解后，用０．４５ μｍ濾器過濾。

ＪＣ－１染色液配制：將ＪＣ－１用二甲基亞砜（ＤＭＳＯ），配制成０．５ ｍｇ／ｍＬ溶液，低溫儲存備用，將ＰＩ用ＰＢＳ配成２０ ｍｇ／Ｌ的溶液。

１．３附睪精子樣品

絨山羊附睪精子來自當地的屠宰場（內蒙古呼和浩特市玉泉區），從屠宰后的成年公白絨山羊收集帶有陰囊的睪丸，用水盒保存（注意樣品不能與冰袋直接接觸），盡快運到內蒙古自治區動物遺傳與繁殖重點實驗室，４℃保存，備用。

１．４精子收集、冷凍及精子常規檢查

睪丸在４ ℃放置２２ ｈ后 （死后２４ ｈ內）從陰囊里分離出來，把附睪尾用手術刀在表面處含有附睪小管的地方對切開，放在培養皿中，用不含卵黃的基礎液在３７℃下進行孵育３０ ｍｉｎ，并用ＰＢＳ洗滌。完成后，將符合要求的新鮮精液分為Ａ、Ｂ兩組，按１∶４的比例用稀釋液（都含卵黃便于對比）進行稀釋，Ａ組樣品在室溫（２３±１）℃下靜置１０ ｍｉｎ 后進行平衡，Ｂ組直接平衡。平衡時放在一個裝有５０ ｍＬ室溫水的１００ ｍＬ的燒杯中，在４℃冰箱使其緩慢降溫平衡３ ｈ，然后進行薰蒸，薰蒸時距液氮４ ｃｍ處，薰蒸時間９ ｍｉｎ，完后直接投入液氮，３０ ｍｉｎ后在３７ ℃水浴鍋中解凍，解凍時間２０ ｓ。

１．５線粒體膜電位的檢測

每一組進行２個試驗處理，分別進行ＪＣ－１單染和ＪＣ－１／ＰＩ雙染，取１０ μＬ精子懸液，加入６．８ μＬ ＪＣ－１染色液，置于３７℃恒溫濕盒中，避光染色３０ ｍｉｎ，在雙染中再加入１０ μＬ ＰＩ溶液，避光染色５ ｍｉｎ，離心棄上清，ＰＢＳ 重懸，調精子密度為５×１０６個／ｍＬ，進行檢測。熒光顯微鏡檢測：將染色后的精液，涂片后于熒光顯微鏡（１０×４０）下觀察不同顏色狀態的精子，每個涂片至少統計精子數為２００個。流式細胞儀檢測：采用美國ＢＤ公司ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型流式細胞儀進行檢測，用４８８ ｎｍ波長激發，應用前向散射光（ＦＳＣ）和側向散射光（ＳＳＣ）射門后，通過熒光通道ＦＬ１－Ｈ和ＦＬ２-Ｈ收集熒光信號，并使用電子補償以糾正綠色熒光（單體）和紅色熒光（聚合物）重疊部分。每份精子懸液樣本獲取１０ ０００個細胞，應用ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ 軟件獲取數據。

１．６統計分析

分析的數據均采用ＳＡＳ ９．０數據統計方法，采用配對ｔ 檢驗，統計各組之間的差異和相關性。

２結果

２．１熒光顯微鏡檢測不同ＭＭＰ精子

兩個處理組中，采用ＪＣ－１單標法可以清楚的看到高ＭＭＰ和低ＭＭＰ精子，采用ＪＣ－１／ＰＩ雙染色法，可以清晰的區分精子的高、低ＭＭＰ精子及精子存活狀態。結果見表１，其中在ＪＣ－１單標法中，樣品尾部線粒體呈桔紅色熒光的精子為高ＭＭＰ精子，樣品尾部線粒體呈綠色熒光的精子為低ＭＭＰ精子，樣品尾部與頭部都呈綠色的精子是線粒體無活性的精子，樣品頭部呈綠色尾部也呈較亮的綠色精子是有活性的低ＭＭＰ的精子（見圖１－Ａ、圖１－Ｂ和圖１－Ｃ）；在ＪＣ－１／ＰＩ雙染中，樣品頭部呈綠色尾部呈橙紅色熒光（ＪＣ－１＋／ＰＩ－）的精子為高ＭＭＰ精子，且是有活性的精子（見圖２－Ａ），樣品頭部呈紅色尾部呈綠色熒光（ＪＣ－１－／ＰＩ＋）的為低ＭＭＰ死精子（見圖２－Ｂ），樣品頭部與尾部都呈綠色熒光的（ＪＣ－１－／ＰＩ－）精子為低ＭＭＰ的活精子（見圖２－Ｃ）。樣品頭部發熒光的精子用紅色箭頭標記，尾部發熒光的用白色箭頭標記（見圖１、圖２）。

２．２ＦＣＭ分析結果

采用ＪＣ－１單標法和ＪＣ－１／ＰＩ雙標法分析精子細胞的線粒體膜電位時，單標法能將高、低ＭＭＰ明顯的區分開來（見圖３），精子采用ＪＣ－１／ＰＩ雙標時法能將精子線粒體的ＭＭＰ高、低及精子的死、活區分開（圖４）。采用ＪＣ－１染色時，確定了高的ＭＭＰ和低的ＭＭＰ精子的比例，采用ＪＣ－１／ＰＩ染色時，確定了ＪＣ－１＋／ＰＩ＋、ＪＣ－１＋／ＰＩ－、ＪＣ－１－／ＰＩ＋和ＪＣ－１－／ＰＩ－的關系（見表１），ＪＣ－１＋／ＰＩ＋為高的ＭＭＰ死精子，ＪＣ－１＋／ＰＩ－為高ＭＭＰ的活精子，ＪＣ－１－／ＰＩ＋是低ＭＭＰ的死精子，ＪＣ－１－／ＰＩ－是線粒體功能喪失的活精子。

２．３熒光顯微鏡與ＦＣＭ檢測分析中單標法和雙染法在不同處理組中相關性分析

見表２，在不同處理組中高ＭＭＰ精子檢測中，在精子線粒體ＭＭＰ和活的與死的精子檢測中，ＦＣＭ檢測與熒光顯微鏡檢測不存在統計學差異，二者相關性顯著。ＪＣ－１染色法與ＪＣ－１／ＰＩ染色法的高ＭＭＰ精子百分率，在流式細胞儀上檢測結果差異不顯著（Ｐ＞０．０５）；采用ＪＣ－１／ＰＩ染色分析顯示，熒光顯微鏡與流式細胞儀檢測的高ＭＭＰ精子結果差異也不顯著（Ｐ＞０．０５）。

３討論

線粒體的主要功能是產生能量，可為精子運動提供ＡＴＰ。用于檢測線粒體膜電位（ＭＭＰ）比較常用的陽離子熒光染料為花青苷（Ｃｙａｎｉｎｅ）、Ｒ１２３、親脂性陰離子為Ｏｘｏｎｏｌ以及本研究用的ＪＣ－１等［８］，Ｃｙａｎｉｎｅ染料中以ＤｉＯＣ５（３）和ＤｉＳＣ３（５）反映膜電位的靈敏度較高，使用較多，但ＤｉＯＣ５（３）容易被細胞中的過氧化酶氧化。目前最新的檢測手段為利用流式細胞術檢測線粒體膜電位的變化，其機制為線粒體存在內負外正膜電位，Ｒ１２３也是一種親脂性陽離子熒光染料，在正常生理條件下帶有１個正電荷，能順利通過活細胞的細胞膜和線粒體膜，進入細胞后可以選擇性地富集在線粒體上，線粒體富集Ｒ１２３的量隨線粒體膜電位的變化而變化，因此測定線粒體羅丹明１２３熒光強度可以反映線粒體膜電位及變化情況，ＪＣ－１是一種親脂性陰離子熒光染料，是檢測線粒體膜電位△ψｍ的理想熒光探針，ＪＣ－１是一種碳氰化合物類熒光染料，在濃度或線粒體膜電位低時以單體存在，激發波長為４８８ ｎｍ，發射波長為５２９ ｎｍ，當濃度升高時形成聚合體，此時激發波長為４９０ ｎｍ，發射波長為５９０ ｎｍ，呈紅橙色熒光。線粒體膜電位分析采用比例法，由于ＪＣ－１能特異地與線粒體內膜結合，只在線粒體內膜崩解時才釋放出來，因此，其檢測結果可靠，敏感性高，在細胞內以聚合物（Ｊ－ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）和單體（ｍｏｎｏｍｅｒ）兩種不同形式存在。在ＭＭＰ較高時，ＪＣ－１聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生橙紅色熒光；在ＭＭＰ較低時，ＪＣ－１不能聚集在線粒體的基質中，此時ＪＣ－１為單體，可以產生綠色熒光。以往對精子ＭＭＰ的檢測多數通過在熒光顯微鏡下鏡檢，現在可以進行流式細胞儀與熒光顯微鏡聯合對精子線粒體膜電位進行檢測，流式細胞術可以快速、高通量、多參數的定量分析，更有利于精子ＭＭＰ的檢測［９］。

由于使用ＪＣ－１單標法在確認精子的死活時流式細胞不能十分準確，本試驗同時采用雙標法（ＪＣ－１／ＰＩ）彌補單標的不足，檢測山羊精子的線粒體時，用ＪＣ－１／ＰＩ染色分析了精子活力，由于ＰＩ能夠滲透進質膜不完整的精子，并能夠激發出強的紅色熒光特征，利用流式細胞儀與熒光顯微鏡檢測樣本時，均取得了較好的結果，這也與Ｇａｒｎｅｒ等［１０］在牛精子上的檢測結果類似。因此，在使用ＪＣ－１／ＰＩ染色時流式細胞儀能夠快速地分析死精子與活精子。在使用ＪＣ－１染色時，熒光顯微鏡與流式細胞儀在區分高、低ＭＭＰ精子方面取得較一致結果，差異不顯著，存在好的線性相關性（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９２２）。本試驗在熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測精子線粒體功能上，用ＪＣ－１和ＰＩ聯合染色后，準確、快速地分析了絨山羊附睪精子的線粒體ＭＭＰ的高低，這與Ｇａｒｎｅｒ等［１０］用此方法在流式細胞儀檢測牛精子線粒體功能上的結果一致。本研究發現，在高ＭＭＰ精子檢測中，ＪＣ－１染色法與ＪＣ－１／ＰＩ染色法的檢測結果差異不顯著（Ｐ＞０．０５），具有很強的相關性；同時采用ＪＣ－１／ＰＩ染色時，熒光顯微鏡與流式細胞儀在檢測高ＭＭＰ精子方面具有強的線性相關性（ｒ＝０．９８２）。同時熒光顯微鏡和流式細胞儀兩種檢測方法各有其優勢，由于ＪＣ－１在精子線粒體內會隨ＭＭＰ的變化激發２種熒光，綠色熒光（５１０～５２０ ｎｍ）和橙色熒光（５９０ ｎｍ），因此在與ＰＩ染料聯合應用時，會出現熒光重疊現象［１０］，ＪＣ－１的多聚體發出的橙色熒光會與ＰＩ的紅色熒光部分重疊［１１］。尤其在檢測高ＭＭＰ死精子和低ＭＭＰ的死精子時，會出現紅色熒光與橙色熒光部分重疊，這樣在流式細胞儀檢測中不利于區分，但用熒光顯微鏡則可很準確地區分開來，因為紅色熒光的ＰＩ著色于精子頭部，而ＪＣ－１著色于精子尾部，所以熒光顯微鏡可以有效地區分高、低ＭＭＰ死精子。這也是本研究同時用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析山羊附睪精子線粒體膜電位的原因之一，這與Ｇａｒｎｅｒ等［１0］在使用ＪＣ－１／ＰＩ染色檢測牛精子的線粒體功能時，流式細胞儀檢測高、低ＭＭＰ死精子存在困難是相一致的。而且通過熒光顯微鏡觀察也發現，雖然死精子中仍有部分精子存在高能線粒體，但其熒光強度，與活精子相比要弱一些［１２］。同時在利用顯微鏡下檢測時，不能很好的觀測低ＭＭＰ的活精子，而流式細胞儀的檢測是以單個細胞通過的方式進行，所以可以避開細胞間的干擾，可將高ＭＭＰ活精子與低ＭＭＰ活精子有效地分開。所以在采用ＪＣ－１／ＰＩ染色對山羊精子的死活以及死活精子ＭＭＰ的檢測時，流式細胞儀能夠有效地區分精子的死活及活精子ＭＭＰ的高低，但不能準確檢測死精子ＭＭＰ；而熒光顯微鏡能夠有效地檢測死精子ＭＭＰ的高低，但對于活精子ＭＭＰ的檢測，效果不理想。采用ＪＣ－１／ＰＩ染色檢測山羊精子的線粒體功能，將流式細胞儀與熒光顯微鏡聯合使用，能比較全面地反映出精子線粒體的功能狀態。

總之，應用流式細胞術ＪＣ－１單標法檢測精子ＭＭＰ是可行的，精子ＪＣ－１＋％可作為分析冷凍過程中精子活力受損的一個關鍵指標，檢測精子ＪＣ－１＋％亦為進一步研究冷凍稀釋液中添加物對精子冷凍前后的影響效果，分析活力下降機理，精子ＭＭＰ變化與冷凍技術的相關性，提供重要的參考。本研究用兩種染色方法和兩種檢測手段確定了絨山羊附睪精子的線粒體活性和精子的死活，用發橙紅色熒光精子百分率，即ＪＣ－１＋％，表示高ＭＭＰ精子的比例，用發紅色的熒光和綠色的熒光來檢測精子的存活（ＰＩ＋／ＰＩ－），實現了對精液樣本ＭＭＰ和活率的快速、可靠檢測，在研究冷凍精液稀釋液配方及提高冷凍精液活力和受胎率方面提供重要的分析研究方法。

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［３］ ＶＡＮ ＤＥＲ ＧＩＥＺＥＮ Ｍ，ＴＯＶＡＲ ＪＯＲＧＥ．Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，２００５，６（６）：５２５－５３０．

［４］ ＫＲＯＥＭＥＲ Ｇ．．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２００３，３０４（３）：４３３－４３５．

［５］ ＬＯＶＥ Ｃ Ｃ， ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｊ Ａ， ＢＲＩＮＳＫＯ Ｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００３，６０：１１２７-１１３８．

［６］ ＨＯＯＲＮＳＴＲＡ Ｄ，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｍ Ａ， ＭＩＫＫＯＬＡ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｏｘｉｎｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，２００３，１７：７４５－７５１．

［７］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ．Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ＪＣ－１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９９，５３：２２２－２２９．

［８］ ＭＡＲＣＨＥＴＴＩ Ｃ，ＪＯＵＹ Ｎ，ＬＥＲＯＹ－ＭＡＲＴＩＮ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｒｅｐ ｒｏｄ， ２００４， １９ （１０）：２２６７－２２７６．

［９］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ． ＪＯＥＲＧ Ｈ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｏｔｏｚｏａ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９７，５７，１４０１－１４０６．

［１０］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ．Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ＪＣ－１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９９，５３：２２２－２２９．

［１１］ ＣＯＳＳＡＲＩＺＺＡ Ａ，ＢＡＣＣＡＲＡＮＩ－ＣＯＮＴＲＩ Ｍ，ＫＡＬＡＳＨＮＩＫＯＶＡ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｉｎｇｔｈｅ Ｊ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｔｉｏｎ５，５′，６，６′－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ－１，１′，３，３′－ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ（ＪＣ－１）［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９３，１９７：４０-４５．

［１２］ ＧＵＴＨＲＩＥ ＨＤ，ＷＥＬＣＨ ＧＲ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ Ｐｅｒｃｏｌｌ－ｔｒｅａｔｅｄ ｖｉａｂｌｅ ｂｏａｒ ｓｐｅｒｍ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，２００６，８４：２０８９－２１００．

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