摘要:為研究褐鱗環(huán)柄菇用于防治桃紅頸天牛,用褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)進(jìn)行毒殺試驗(yàn),處理3 d后桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的死亡率為71.67%;發(fā)酵菌液經(jīng)超聲波破碎離心提取上清液,分別配置成體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%、20%的稀釋液,對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)進(jìn)行毒殺試驗(yàn),當(dāng)上清液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%以上時(shí)毒殺作用明顯,桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率達(dá)到80.00%以上,與10%的處理存在極顯著差異;上清液進(jìn)行不同溫度處理、pH值調(diào)節(jié)、有機(jī)溶劑添加后,對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性最高的處理分別是溫度20 ℃、pH值7.0、有機(jī)溶劑95%乙醇。
關(guān)鍵詞:桃紅頸天牛;褐鱗環(huán)柄菇;毒性反應(yīng);發(fā)酵菌液
中圖分類號(hào):S436.621.2+9;S482.3+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2011)12-2446-03
Toxic Reaction of Zymotic Liquid of Lepiota helveola on Early Instar Larvae
of Aromia bungii
HONG Na,YANG Shao-bin
(College of Biological and Environmental Engineering,Shenyang University,Shenyang 110044,China)
Abstract: In order to study the prevention and cure effect of Lepiota helveola Bres. on Aromia bungii(Faldermann), zymotic liquid of L. helveola was used in poisoning experiment of early instar larvae of A. bungii. It showed that the mortality was 71.67% 3 days later. The supernate produced by breaking fermented liquid culture through ultrasonic centrifugation was made into different volume fraction of diluent, 5%, 10%, 15%, and 20%, then texted on Aromia bungii. When the volume fraction of supernatant was above 15%, toxic effects were obvious. The mortality of early instar larvae of Aromia bungii went to 80.00% and was significantly higher than that of the supernate of 10% diluent. The best conditions for poisoning early instar larvae of Aromia bungii were 20 ℃, pH 7.0, and 95% ethanol for organic solvent.
Key words: Aromia bungii(Faldermann); Lepiota helveola Bres.; toxicity reaction; fermented liquid
桃紅頸天牛(Aromia bungii)屬于鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)害蟲(chóng)。其幼蟲(chóng)危害果樹(shù)林木,在樹(shù)體皮層和木質(zhì)部鉆蛀隧道,影響水分和養(yǎng)分的輸送,常造成樹(shù)干中空,皮層脫離,致使樹(shù)勢(shì)衰弱、降低產(chǎn)量,嚴(yán)重者可致樹(shù)體死亡、果園絕產(chǎn)。其食性較雜,寄主包括桃、板栗、花椒、石榴、桑等[1-4],對(duì)我國(guó)各核果類果樹(shù)栽培區(qū)均已造成危害,特別對(duì)盛果期的成年果樹(shù)危害尤為嚴(yán)重[5]。
有毒大型真菌分布廣泛,其中一些可產(chǎn)生對(duì)昆蟲(chóng)有明顯的抑制或毒性作用的活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)可利用于農(nóng)林業(yè)對(duì)植物害蟲(chóng)的生物防治,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。 褐鱗環(huán)柄菇(Lepiota helveola Bres.)屬傘菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)環(huán)柄菇屬(Lepiota)真菌,分布范圍廣,含有毒肽類毒素,具有較大毒性[7]。試驗(yàn)選用其發(fā)酵菌液及發(fā)酵菌液經(jīng)超聲波處理后離心分離的上清液,研究其對(duì)蛀干性害蟲(chóng)桃紅頸天牛的毒性作用,為開(kāi)發(fā)利用菌物新資源提供參考。
1材料和方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1試驗(yàn)昆蟲(chóng)桃紅頸天牛幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的成蟲(chóng)后代,選用剛孵化的正常初齡幼蟲(chóng)。
1.1.2試驗(yàn)菌褐鱗環(huán)柄菇菌種由沈陽(yáng)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.3褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液在250 mL三角瓶中裝入不加瓊脂的改良PDA培養(yǎng)基100 mL,用移液管加入無(wú)菌水5 mL于純化好的真菌斜面并用接種針刮取菌絲體制成菌懸液,將菌懸液倒入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中,搖床發(fā)酵。搖床溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速110 r/min,發(fā)酵時(shí)間7 d,成褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液。
1.1.4褐鱗環(huán)柄菇上清液將褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液用JY99—2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(功率200 W,工作/間歇1 s/1 s,20 min)破碎,10 000 r/min冷凍離心得上清液。
1.1.5木屑新鮮京桃(Prunus persica f. rubro-plena)樹(shù)枝經(jīng)微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎后,過(guò)30目篩。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液對(duì)桃紅頸天牛幼蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)稱取5 g木屑、1 mL褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液混勻后平鋪于培養(yǎng)皿中。取20頭桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿中。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。以清水代替發(fā)酵菌液作相同處理為對(duì)照。培養(yǎng)皿置陰暗處3 d后觀察,記錄毒殺情況,計(jì)算死亡率。
1.2.2褐鱗環(huán)柄菇上清液對(duì)桃紅頸天牛幼蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)將上清液用無(wú)菌水稀釋成體積分?jǐn)?shù)(上清液/稀釋液)分別為A1 5%、A2 10%、A3 15%、A4 20%的溶液。按1.2.1的方法分別用A1、A2、A3、A4進(jìn)行桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)。空白對(duì)照(A0)以清水替代上清液稀釋液。3 d后觀察,記錄毒殺情況,分析數(shù)據(jù)。
1.2.3不同溫度處理對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液殺蟲(chóng)活性的影響褐鱗環(huán)柄菇上清液10 mL經(jīng)0、20、40、60、80、100和121 ℃各處理30 min,測(cè)定不同溫度處理后的上清液殺蟲(chóng)活性變化。其中,121 ℃處理為高壓滅菌鍋內(nèi)溫度穩(wěn)定20 min,0 ℃為冰水混合物水浴30 min,20、40、60、80、100 ℃為同溫水浴30 min,然后按1.2.1的方法分別用處理后的上清液進(jìn)行試驗(yàn)。3 d后觀察毒殺情況,分析數(shù)據(jù)。
1.2.4酸堿度對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液殺蟲(chóng)活性的影響將褐鱗環(huán)柄菇上清液10 mL分別用HCl或NaOH調(diào)pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。然后按1.2.1的方法分別用不同pH值的上清液進(jìn)行天牛初齡幼蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)。3 d后觀察毒殺情況,分析數(shù)據(jù)。
1.2.5有機(jī)溶劑對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液殺蟲(chóng)活性的影響在30 mL上清液中分別加入等體積的無(wú)水甲醇、95%乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮,室溫下自然揮發(fā)至30 mL,然后按1.2.1的方法分別用不同有機(jī)溶劑處理后的上清液進(jìn)行天牛初齡幼蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)。分別用相應(yīng)溶劑30 mL加等體積清水后自然揮發(fā)至30 mL的混合液處理木屑作為對(duì)照。3 d后檢查毒殺情況,分析數(shù)據(jù)。
1.3數(shù)據(jù)處理
死亡率=×100%
采用SPSS13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
2結(jié)果與分析
2.1褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的毒殺效果
從試驗(yàn)結(jié)果(表1)可見(jiàn),褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵菌液對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)毒殺效果明顯,3 d后的幼蟲(chóng)死亡率為71.67%,遠(yuǎn)高于對(duì)照。
2.2褐鱗環(huán)柄菇上清液對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的毒殺效果
從褐鱗環(huán)柄菇上清液在不同稀釋倍數(shù)下對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的致死情況(表2)可以看出,隨處理中所用褐鱗環(huán)柄菇提取液體積分?jǐn)?shù)的增加,桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率上升。
2.3處理溫度對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液活性的影響
從試驗(yàn)結(jié)果(表3)可以看出,經(jīng)不同溫度處理后,褐鱗環(huán)柄菇上清液對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)效果明顯不同。20 ℃處理后褐鱗環(huán)柄菇上清液殺蟲(chóng)活性最大,桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的死亡率為85.00%。隨著處理溫度的升高或降低,桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率明顯下降,其中,40、60、80、100 ℃處理之間存在極顯著差異。原因可能是隨著溫度升高,上清液中褐鱗環(huán)柄菇細(xì)胞破碎更充分,胞內(nèi)物質(zhì)釋放得更徹底;但溫度超過(guò)40 ℃,褐鱗環(huán)柄菇所釋放得有毒物質(zhì)會(huì)隨處理溫度的升高而導(dǎo)致受破壞程度加劇,最終上清液中有毒物質(zhì)含量降低,試驗(yàn)所得桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率明顯下降。可見(jiàn)上清液最適處理溫度為20 ℃左右。
2.4酸堿度對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液活性的影響
從試驗(yàn)結(jié)果(表4)可以看出,褐鱗環(huán)柄菇上清液pH值為7.0時(shí),桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率最高,達(dá)85.00%。上清液酸性或堿性增強(qiáng),桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率都快速降低,多數(shù)相鄰pH值之間的幼蟲(chóng)死亡率存在極顯著差異。pH值為7.0時(shí),褐鱗環(huán)柄菇上清液表現(xiàn)出對(duì)桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的最高殺蟲(chóng)活性;而pH值達(dá)到3.0或高于10.0,桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的死亡率均和對(duì)照相接近,可見(jiàn)酸堿度對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液殺蟲(chóng)活性有較大影響。原因可能為上清液中表現(xiàn)出殺蟲(chóng)活性的毒素為毒肽等蛋白多肽類物質(zhì),這些蛋白多肽類物質(zhì)在酸性和堿性環(huán)境下容易被破壞,故在不同pH值環(huán)境下,上清液的殺蟲(chóng)活性明顯不同。
2.5不同有機(jī)溶劑對(duì)褐鱗環(huán)柄菇上清液活性的影響
從試驗(yàn)結(jié)果(表5)可以看出,經(jīng)有機(jī)溶劑處理,褐鱗環(huán)柄菇上清液仍有較強(qiáng)殺蟲(chóng)活性,其中以添加過(guò)95%乙醇的上清液所致桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)死亡率最高,達(dá)91.67%,與加入乙醚、乙酸乙酯、丙酮的上清液處理的幼蟲(chóng)死亡率差異極顯著。與溶劑+清水處理相比,各處理桃紅頸天牛初齡幼蟲(chóng)的死亡率均呈極顯著差異。所選有機(jī)溶劑使上清液的毒性增加,原因可能是經(jīng)有機(jī)溶劑處理后,上清液中的多肽類毒素溶于有機(jī)相中,增加了可溶性毒素含量。95%乙醇處理后的上清液殺蟲(chóng)活性最強(qiáng),但與無(wú)水甲醇處理相比差異不顯著,如考慮甲醇對(duì)人體和環(huán)境的不良影響遠(yuǎn)大于乙醇,所以在幾種有機(jī)溶劑中以95%乙醇作為上清液的處理劑最為適宜。
3討論
以大型真菌為材料制備殺蟲(chóng)劑的相關(guān)研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視,在較多大型真菌中發(fā)現(xiàn)了具明顯殺蟲(chóng)活性的物質(zhì)。Kubo等[8]發(fā)現(xiàn)毒蘑菇(Clitocybe inversa)對(duì)果蠅和粘蟲(chóng)有較強(qiáng)的毒性;擔(dān)子菌側(cè)耳屬(Pleurotus)[9]和雞油菌(Cantharellus cibarius)[10]中的部分種具有殺線蟲(chóng)活性物質(zhì);肉座菌科菌寄生菌屬真菌(Hypomyces sp.)在紅外光線照射下對(duì)松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)有明顯的毒殺活性[11];蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)是蟲(chóng)草屬真菌中寄主范圍較廣的一個(gè)種,它對(duì)幼蚊有毒殺作用[12]。
目前在桃紅頸天牛的防治中主要使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑,這些殺蟲(chóng)劑會(huì)產(chǎn)生藥物殘留問(wèn)題,也可引起桃紅頸天牛抗藥性增強(qiáng)。大型有毒真菌毒素存在于自然界中,用以防治桃紅頸天牛,可實(shí)現(xiàn)毒殺效率和無(wú)殘留、無(wú)公害兼顧。大型有毒真菌資源豐富,種類繁多,通過(guò)液體深層發(fā)酵可獲得大量的殺蟲(chóng)活性物質(zhì),利用其開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)殺蟲(chóng)劑具有良好的應(yīng)用前景。試驗(yàn)可見(jiàn),褐鱗環(huán)柄菇發(fā)酵液對(duì)桃紅頸天牛幼蟲(chóng)的毒殺效果突出,尤其在上清液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%以上時(shí),初齡幼蟲(chóng)死亡率達(dá)到80.00%以上。
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注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文