Bcl-2、Bax及Caspase-9在子宮內膜異位癥中的表達及其意義

[摘要]目的 探討Bcl-2，Bax及Caspase-9在子宮內膜異位癥（Endometrosis，EMS）患者異位內膜中和在位內膜中的表達及其意義。方法 采用Western Blot法檢測Bcl-2，Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者異位及在位內膜組織中的半定量表達情況。結果 Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者在位內膜的相對半定量表達值分別為0.5189±0.5176、0.4676±0.2346和0.2873±0.1018，而在異位內膜中分別為0.7348±0.4372、0.2327±0.2417和0.1447±0.1209。異位內膜中的Bcl-2蛋白的表達高于在位內膜，而Bax及Caspase-9蛋白低于在位內膜，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。結論 與在位內膜相比，EMS患者的異位內膜中的Bcl-2蛋白的表達升高，而Bax及Caspase-9蛋白表達降低，細胞凋亡能力減弱，可能是致使異位的子宮內膜組織在異位種植生長，導致EMS發生發展的機制之一。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥；Bcl-2；Bax；Caspase-9；細胞凋亡

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）33-01-02

The Expression and Its Significance of Bcl-2，Bax and Caspase-9 in Patients with Endometrosis

WANG Yuanxiang

Rudong County People's Hospital of Jiangsu Province，Rudong 226400，China

[Abstract] Objective To discuss the expression and significance of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium and in ectopic in patients with endometrosis. Methods The semiquantitative expression of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium and in ectopic in patients with endometrosis were detected by Western Blot. Results The semiquantitative expression of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at inectopic in patients with endometrosis were 0.5189±0.5176，0.4676±0.2346 and 0.2873±0.1018 respectively. while 0.7348±0.4372，0.2327±0.2417 and 0.1447±0.1209 at ectopic endometrium. The expression of Bcl-2 at ectopic endometrium was higher than the inectopic ones; while the expression of Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium was lower than the inectopicones，and there were statistically significance（P＜0.05）. Conclusion Compared with the inectopic endometrium，the expression of Bcl-2 was higher while the expression of Bax and Caspase-9 were lower，which indicated that the ability of cell apoptosis decreased，and which caused ectopic endometrium organizations growing in ectopic place，and may be one of the mechanism which leading to the occurrence and development of endometrosis.

[Key words] Endometrosis；Bcl-2；Bax；Caspase-9；cell apoptosis

子宮內膜異位癥（endometrosis，EMS）是生育年齡婦女常見疾病之一，發病率為10%～15%[1]。EMS是良性激素依賴性疾病，具有類似惡性腫瘤遠處轉移和種植生長的能力，在患者不孕癥中約40%由EMS所致[2]。EMS目前發病機制仍不明確，治療效果也不甚理想，探討EMS發病機制一直是婦科研究領域的熱點。近年來研究發現細胞凋亡在EMS的發病過程中起重要作用，本研究探討了Bcl-2，Bax及Caspase-9在EMS患者異位內膜中和在位內膜的表達情況及其表達的意義。

1 資料與方法

1.1 標本收集

收集2008年1月～2011年1月我院婦產科行手術治療的32例EMS患者異位內膜中和在位內膜標本，術后均經病理學證實為EMS，所有的子宮內膜都處于增生期，僅少部分標本夾雜有分泌期改變。中位年齡33歲（29～36歲），手術前3個月均無特殊藥物治療。

1.2 實驗材料

Bcl-2、Bax及Caspase-9一抗為多克隆山羊抗人抗體，二抗為HRP 標記的兔抗山羊多克隆抗體，內參為HRP 標記的單克隆鼠抗人β-action抗體，Marker為預染蛋白Marker，均為美國Santa Cruz公司產品。RAPA裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL 化學發光試劑盒均為上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

1.3 Western Blot測定

所有新鮮標本取下后立即置EP管放入液氮罐中保存。用眼科剪將組織標本盡量剪碎，用RAPA 裂解液裂解組織，提取總蛋白，用BCA 法測每一組的蛋白濃度，制備12% SDS-PAGE，上樣量為100 μg總蛋白/泳道，進行電泳，經干法轉印到PVDF膜上（Amresco 公司，美國），室溫下用5% BSA-TBST封閉1h，分別加入Bcl-2、Bax及Caspase-9兔抗人多克隆抗體（1∶50 稀釋）及GAPDH兔抗人單克隆抗體（1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜，然后加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶8000 稀釋），室溫下孵育3h，TBST 洗滌，加入發光劑ECL自顯影。Bcl-2、Bax及Caspase-9相對含量用Bcl-2或Bax或Caspase-9/β-action灰度比值表示（灰度用Gel-Pro Analyzer 分析）。每組重復3 次。

1.4 統計學處理

應用SPSS 13.0 統計分析軟件分析實驗數據，其中計量資料以均數±標準差（χ±s）表示，計量資料進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Western-blot 免疫印跡結果顯示，EMS患者異位內膜中和在位內膜可檢測到Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白的表達（圖1）。以β-action作為內參照，Bcl-2或Bax或Caspase-9/β-action的灰度比值分別代表Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白的相對半定量表達。如表1所示，Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者在位內膜相對半定量的表達值分別為0.5116±0.0071、0.4497±0.0166和0.2488±0.0370，而異位內膜中分別為0.7306±0.0175、0.2352±0.0051和0.1432±0.0017。在位內膜中Bcl-2蛋白的表達低于異位內膜中，而Bax及Caspase-9蛋白高于異位內膜中，差異均具有統計學的意義（P＜0.01）。

1～3 異位內膜中；4～6 在位內膜

3 討論

1860年，Roktanskv在尸體解剖中首次發現EMS，隨著診斷水平的提高，EMS已成為生育年齡婦女的常見病，發病率為10%～15%[1]，在婦科疾病中其發病率僅次于子宮肌瘤[3]，在患者不孕癥中約40%由EMS所致[2]。EMS是良性激素依賴性疾病，具有類似惡性腫瘤遠處轉移和種植生長的能力。140年來科學家一直致力于EMS發病機制的研究，但目前發病機制仍不明確，治療效果也一直不甚理想，探討EMS發病機制一直是婦科研究領域的熱點。

近年來研究發現細胞凋亡在EMS的發病過程中起重要作用。Bcl-2基因家族是公認的參與細胞凋亡調控的重要基因，Bcl-2和Bax是家族中最重要的一對正負凋亡調控因子。Bcl-2被稱為“凋亡抑制基因”，過度表達可通過抑制程序性細胞死亡來阻礙或延遲正常細胞的分化，從而延長細胞的壽命；Bax是促凋亡基因，可以自身形成同源二聚體誘導凋亡[4]。正常子宮內膜Bcl-2與Bax表達具有一定周期性，Konno等[5]研究發現Bcl-2在正常子宮內膜月經周期增生期腺細胞和晚期分泌期腺細胞中的表達情況不同，Bcl-2在前者有較強的表達，而在后者無表達；Bcl-2表達增殖期高于分泌期，Bax表達分泌期高于增殖期，正是Bcl-2與Bax表達的周期性維持了月經周期的規律性。國內外研究顯示，Bcl-2在EMS患者與正常婦女原始卵泡中的表達量不同，Bcl-2在前者的表達顯著升高[2]；而Bcl-2在EMS卵巢異位內膜中、在位內膜及正常子宮內膜的表達也不同，其在EMS卵巢異位內膜中的表達顯著增強[6]。

本研究結果顯示，與在位內膜相比，EMS患者異位內膜中Bcl-2表達升高，而Bax表達減弱，Bcl-2/Bax比值上升，提示異位內膜中細胞凋亡減弱，增殖能力增強。這樣的內膜細胞抗凋亡能力明顯增強，破壞了細胞增殖和凋亡的平衡，容易異位于盆腹腔或腹壁切口種植生長及不斷發展，支持“在位內膜決定論”。異位子宮內膜Bcl-2和Bax表達異常可能參與了EMS子宮內膜凋亡特性的改變，對EMS的發生和發展起到一定的作用。

細胞凋亡機制的研究中提出兩條主要信號途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑[7]。Caspases是凋亡信號轉導的共同通路，許多調控細胞凋亡的因素都通過caspases酶系起作用。在凋亡的線粒體途徑中，Caspase-9位于Caspae級聯反應的上游，是最重要的起始因子，也是關鍵蛋白酶。Caspase-9活化從而激活效應Caspase-3而導致細胞凋亡。本研究結果顯示，與在位內膜相比，EMS患者異位內膜中Caspase-9表達減弱，進一步驗證了異位內膜中細胞凋亡能力減弱，并且可能是通過抑制線粒體途徑誘導的細胞凋亡而實現[8]。

綜上所述，與在位內膜相比，EMS患者的異位內膜中Bcl-2蛋白的表達降低，而Bax及Caspase-9蛋白表達升高，細胞凋亡能力減弱，可能是致使異位的子宮內膜組織在異位種植生長，導致EMS發生發展的機制之一。但受樣本例數的限制，有待擴大樣本量進一步研究。

[參考文獻]

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[3] Gianetto-BerruttiA，FeylesV. Endometriosis related to infertility[J]. MinervaGinecol，2003，55（5）：407-416.

[4] Malla R，Gopinath S，Alapati K，et al. Downregulation of uPAR and cathepsin B induces apoptosis via regulation of Bcl-2 and Bax and inhibition of the PI3K/Akt pathway in gliomas[J]. PLoS One，2010，5（10）：e13731.

[5] Konno R，Yamakawa H，Utsunolmiya H，et al. Expression of survivin and Bcl-2 in normal human endometrium[J]. Mol Hum Reprod，2000，6（6）：529-534.

[6] 于靜，王化麗，王長智. Bcl-2蛋白在子宮內膜異位癥的表達及意義[J].中國婦幼保健. 2004，19（3）： 34-36.

[7] Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis[J].Nature，2000，407（6805）：770-776.

[8] 史呋香. 子宮內膜異位癥60例臨床觀察[J]. 臨床合理用藥雜志，2010，3（8）：59-60.

（收稿日期：2011-09-16）