夾心ELISA檢測血清結締組織生長因子及其初步臨床應用

【摘要】 目的 應用抗結締組織生長因子（CTGF）單克隆抗體和抗CTGF多克隆抗體，建立CTGF免疫分析方法，用其方法檢測血清中CTGF含量初步驗證其臨床應用價值。方法 使用抗CTGF的單克隆抗體包被反應板，辣根過氧化物酶標記兔抗人CTGF多克隆抗體(二抗)建立雙抗體夾心方法，通過方陣滴定法確定包被抗體和酶標抗體的最適工作濃度；以純化的CTGF抗原為標準品建立標準曲線；以重復性、靈敏性和回收率實驗評價ELISA方法。使用該檢測系統和進口試劑盒對照，檢測其準確性和可比性。利用該系統檢測臨床有肝纖維化癥狀的患者血清標本，初步評價其臨床應用價值。結果 該方法有較高的靈敏度、特異性及穩定性，最低檢測限批間和批內變異系數分別為0.98 ng/ml、9.8%、4.9%。與進口試劑盒有很強的可比性，兩者的相關系數r=0.988。初步臨床標本檢測證實，肝硬化、慢性肝炎急性肝炎患者的血清CTGF含量明顯高于建康對照者(P<0.01)，肝硬化患者的血清CTGF水平明顯高于慢性肝炎和急性肝炎患者（P<0.01）。結論 成功地建立了一種測定血清CTGF的雙抗體夾心方法，該反應系統有較高的靈敏度和特異性，和進口試劑盒有很強的可比性，為臨床廣泛使用打下了基礎。

【關鍵詞】 乙型肝炎； 結締組織生長因子； ELISA

The establishment of sandwich ELISA measuring serum connective tissue growth factor and its clinical value SHI Yu-ling.The First Peoples Hospital of Xiangcheng in Henan Province，Xiangcheng 466200，China

【Abstract】 Objective To establish immunologic assay detecting serum connective tissue growth factor(CTGF)using anti-CTGF monoclone antibodies and anti-CTGF polyclone antibodies.Validated the clinical value of the ELISA system.Methods Plates were coated by anti-CTGF monoclonal antibodies，HRP conjugated anti-CTGF polyclonal antibody was used as detecting antibodies.The optimization reactivity conditions were analyzed by chessboard titrimetric method.Compare the ELISA system and imported ELISA kit detecting CTGF for validating the accurate and comparability of the ELISA system.Results The ELISA system had perfect sensitivity，specificity and stability，the minimum determinable dose，intra-assay and inter-assay coefficients of variation(CV)was 0.18 ng/ml，9.8% and 4.5%，respectively.Correlation coefficient was 0.988 between the ELISA system and imported ELISA kit.Serum level of CTGF in patients with liver cirrhosis was significantly higher than that in chronic hepatitis and control group.Conclusion The sandwich ELISA detecting serum CTGF was successfully established.The ELISA had a perfect sensitivity，specificity and comparability with imported ELISA kit，which lay the foundation for wide clinical application.

【Key words】 Hepatitis B； Connective tissue growth factor； ELISA

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纖維化疾病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，其形成是一個多因素、多細胞參與的復雜過程，細胞因子網絡始終是人們的研究熱點，其中轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被認為是具有致纖維化作用的最主要細胞因子之一。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種新發現的細胞因子，在TGF-β的誘導下，CTGF可由成纖維細胞等間質細胞產生，反過來又介導TGF-β對間質細胞的作用，可促進細胞增生和細胞外基質（ECM）合成等。因此，CTGF已成為纖維化領域中新的研究熱點［1~3］。

纖維化疾病的治療效果在于早期診斷，目前，對纖維化疾病的診斷主要是檢測血清膠原成分（如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原）及前膠原的含量，而作為膠原合成的上游作用的細胞因子CTGF在血清內的變化更能反應纖維化發生的趨勢及進程，遠早于血清內膠原的變化。因此，建立一種靈敏、特異的CTGF檢測方法對纖維化疾病的診斷及早期治療具有十分重要的意義。應用抗結締組織生長因子（CTGF）單克隆抗體和抗CTGF多克隆抗體，建立CTGF免疫分析方法，用其方法檢測血清中CTGF含量，可以應用于臨床纖維化疾病的實驗室早期診斷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 抗原抗體稀釋液、抗CTGF單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體均購自美國Sigma公司；TMB顯色液（美國Thermo公司）；酶標板（Nunc產品）；純化的CTGF標準品（美國RD公司）；CTGF定量檢測試劑盒（美國Rapidbio Lab）；BIO-RAD Model 550酶標儀（LKH產品）；8823 B型紫外檢測器（北京賓達英創科技有限公司產品）；37 ℃恒溫孵箱（Fisher scientific產品）；Opsys MR酶標儀、洗板機。

1.2 ELISA方法的建立

1.2.1 實驗條件的選擇 用包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將包被抗體稀釋成5 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml和0.5 μg/ml 4 個濃度包被酶標板，用抗體稀釋液（1％BSA/PBST）將酶標抗體（0.4 mg/ml）稀釋成1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800 4個梯度，設定棋盤滴定實驗，確定包被單克隆抗體和酶標抗體的工作濃度。以陽性孔OD 450值在1.0左右，空白孔的OD 450小于0.1的條件作為最佳抗體工作濃度。

1.2.2 ELISA實驗的重復性、穩定性及特異性 對混合血清樣本(健康對照)重復檢測15次(每次測定2復孔，取其平均值)；反復進行6次重復實驗，分別計算批內及批間變異系數(CV)。同時將制備好的試劑盒于37 ℃溫箱放置4 d，與4 ℃保存的試劑盒平行檢測健康對照血清，每份同時檢測2次，以測定本檢測方法的穩定性。

1.2.3 血清CTGF含量的檢測 用包被液將稀釋成一定濃度的CTGF mAb分別滴加在96孔聚苯乙烯板微孔內，100 μl/孔，4 ℃過夜，次日用0.5 ml/LT ween-20 PBS(PBST)洗板3次，每次3 min；拍干后加封閉液(含150 ml/L小牛血清的PBS)，200 μl/孔，37 ℃，1 h，4 ℃過夜。次日棄之，PBST洗滌3次，每次3 min。加入稀釋的CTGF標準品：1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml，以及待測樣品(1∶10稀釋)50 μl/孔，并設空白對照，37 ℃水浴1 h，PBST洗板5次；加辣根過氧化物酶標記的CTGF多克隆抗體，37 ℃水浴30 min，PBST洗板5次，徹底拍干后加入TMB顯色劑，37 ℃，15 min，加2 mol/L H2SO4終止液終止反應。酶標儀450 nm處測量吸光度A值。

1.3 試劑盒對比實驗 隨機取20份臨床肝炎血清標本，用本法與美國加利福尼亞州Rapidbio Lab實驗室生產的CTGF定量ELISA試劑盒進行對比實驗。

1.4 統計學處理 應用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理，檢測結果以均數±標準差（x±s）表示，兩組間計量資料比較用t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗影響因素 經方陣滴定確定，抗CTGF mAb最終包被的稀釋比例為1∶200，測定包被濃度約為2 μg/ml。血清稀釋倍數1∶10，生物素化多克隆抗體的最佳工作濃度1∶400。

2.2 重復性、穩定性及靈敏度 健康對照組血清批內CV為4.19%，批間CV為9.80%，批內、批間CV均符合要求。表明本法具有較好的重復性，精確度較高。穩定性實驗經t檢驗分析結果表明：用37 ℃溫箱放置4 d的試劑盒與4 ℃保存的試劑盒先后檢測肝硬化和健康對照血清，兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。按37 ℃放置1天相當于4 ℃放置1.6個月計算，該試劑盒在4 ℃至少穩定6個月。該方法的最低檢測限為0.98 ng/ml。

2.3 對比實驗 隨機取20份臨床肝炎血清標本，同時以本法與美國Rapidbio Lab 實驗室生產的CTGF定量ELISA試劑盒進行檢測，檢測結果表明，兩者之間相關系數(r)為0.988，直線回歸方程為:Y=0.0095+0.9901 X。見圖1。

2.4 臨床檢測應用 用自行研制的CTGF定量試劑盒，檢測101例臨床診斷明確的肝病患者（其中急性肝炎31例，慢性肝炎41例，肝硬化29例）及60例健康對照血清標本，結果表明肝硬化、慢性肝炎急性肝炎的血清CTGF含量明顯高于建康對照，肝硬化患者的血清CTGF水平明顯高于慢性肝炎和急性肝炎患者。并與對照組比較顯示，從急性肝炎到慢性肝炎再到肝硬化，隨著病損纖維化程度的加重，CTGF水平呈持續上升趨勢(P<0.001)。見表1。

3 討論

肝纖維化主要靠肝組織穿刺活檢診斷，但由于這是一種侵入性檢查，且費用高，因而限制了其廣泛使用，尋找一種良好的肝纖維化血清學指標具有很大的實用價值。大量研究表明CTGF在正常肝組織中僅有少量表達，在肝纖維化時CTGF表達升高且與肝纖維化程度相關。由體內細胞產生的CTGF可以直接分泌到細胞外間隙，并進入體循環，因此，使用ELISA檢測血液中CTGF濃度被認為是一種診斷和評估纖維化程度的一個良好指標［4］。

由于目前CTGF檢測試劑盒均為國外進口，價格昂貴，很大程度上限制了在國內的臨床應用，本研究應用CTGF單克隆抗體和多克隆抗體構建了定量檢測血清CTGF濃度的ELISA方法。筆者使用該試劑盒與美國RB公司生產的CTGF定量ELISA試劑盒進行對比，來驗證該系統的準確性。結果顯示，筆者構建的ELISA檢測系統和RB公司的試劑盒有很好的相關性，兩者的相關系數r=0.998。對兩份混合血清樣本(肝硬化、健康對照)重復檢測15次，結果顯示，肝硬化組和健康對照組血清批內CV分別為4.19%、6.60%，批間CV分別為9.80%、11.82%，說明該試劑盒的有較高的精密度。為了進一步驗證該試劑盒的臨床應用價值，筆者使用該方法檢測了208例肝病患者及60例健康對照的血清標本，結果顯示，肝硬化、慢性肝炎急性肝炎患者的血清CTGF含量明顯高于建康對照者(P<0.001)，肝硬化患者的血清CTGF水平明顯高于慢性肝炎和急性肝炎患者。并與對照組比較顯示從急性肝炎到慢性肝炎再到肝硬化，隨著病損纖維化程度的加重，CTGF水平呈持續上升趨勢，這與Gressner等的研究結果相似［5］，和研究預期相符。

ELISA方法操作簡便，不需要特殊的檢測儀器，筆者構建的反應系統有較高的靈敏度和特異性，和進口試劑盒有很強的可比性，為臨床廣泛使用打下了基礎。筆者認為本試劑盒適應范圍廣，實驗操作簡便，特異、敏感、快速，適于科研機構、醫院及基層醫療單位應用。

參 考 文 獻

［1］ Zhang D，Wang NY，Yang CB，et al.The clinical value of connective tissue growth factor in the assessment of liver fibrosis.Dig dis sci，2010，55:767-774.

［2］ Kovalenko E，Tacke F，Gressner OA，et al.Validation of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) and its gene polymorphisms as noninvasive biomarkers for the assessment of liver fibrosis.J Viral Hepat，2009，16:612-620.

［3］ Matsui Y，Sadoshima J.Rapid upregulation of CTGF in cardiac myocytes by hypertrophic stimuli:implication for cardiac fibrosis and hypertrophy.J Mol Cell Cardiol，2004，37:477-481.

［4］ Tamatani T，Kobayashi H，Tezuka K，et al.Establishment of the enzyme-linked immunosorbent assay for connective tissue growth factor(CTGF)and its detection in the sera of biliary atresia.Biochem Biophys Res Commun，1998，251:748-752.

［5］ Gressner AM，Yagmur E，Lame B，et al.Connective tissue growth factor in serum as a new candidate test for assessment of hepatic fibrosis.Clin Chem，2006，52:1815-1817.

（收稿日期：2011-08-03）

（本文編輯：郎威）