腎穿組織免疫熒光及HE染色方法的改良

【摘要】 目的 探討腎臟穿刺活檢組織行直接免疫熒光法及HE染色技術的改良，并用AB兩組對比的方式顯示改良前后的優缺點。方法 腎臟穿刺活檢組織免疫熒光及HE染色技術的改良。結果 改良后的腎穿組織免疫熒光技術及HE染色技術大大縮短操作時間，HE染色上色均勻，核漿對比明顯。結論 腎活檢病理是根據腎臟疾病的發病特點，在一般病理學方法的基礎上，吸收了免疫病理（免疫熒光、免疫酶標）、超微病理等先進手段而完成的。腎穿刺組織的病理檢查包括光鏡觀察及電鏡檢查兩部分，免疫熒光及HE染色是光鏡觀察的重要組成部分。腎活檢有利于明確診斷、指導治療、判斷預后、探討臨床分型與病理分型的關系，也是提高腎臟病臨床與科研水平的重要手段之一。

【關鍵詞】 腎穿刺活檢； 免疫熒光； HE染色

The kidney wears to organize the improve that immunity fluorescence and HE dye a method ZHENG Yan-xuan，WANG Xiao-hong，CAO Wan-wei，et al.The Fifth Hospital Affiliated to Zhongshan University，Zhuhai 519000，China

【Abstract】 Objective To investigate the renal biopsy tissue of direct immunofluorescence and HE staining techniques improved，and two sets of AB comparison with improved display before and after the advantages and disadvantages.Methods Kidney biopsy tissue immunofluorescence and HE staining technology improvements.Results To improve the renal biopsy tissue immunofluorescence and HE staining techniques greatly reduce the operating time，HE stain color uniformity，contrast obvious nucleus and cytoplasm.Renal biopsy findings are based on the clinical characteristics of kidney disease in the general pathology methods，based on the absorption of the immune pathology (immunofluorescence， immune ELISA)，Ultrastructural and other advanced means complete.Pathological examination of renal biopsy，including light microscopy and electron microscopy of two parts，immunofluorescence and light microscopy of HE staining was an important part.Biopsy would help confirm the diagnosis，guide treatment，prognosis，classification of clinical and pathological sub-type relationship，but also to improve the level of kidney disease an important clinical and scientific means.

【Key words】 The kidney wear a sting to live check； Immunity fluorescence； HE staining

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腎小球腎炎（簡稱腎炎）是以腎小球損害為主的變態反應性炎癥，是一種比較常見的疾病［1］。臨床表現主要有蛋白尿、血尿、水腫和高血壓等。腎小球腎炎根據腎組織病變范圍、腎小球病變情況可進行不同的分類，而唯一明確分類的診斷方法就是進行腎穿刺活檢。腎穿刺活檢損傷小，獲取的腎組織新鮮，不但適合常規病理檢查，而且適合免疫病理學、超微病理學以及其他現代先進方法的研究，對腎臟疾病的診斷、治療和預后判斷具有無可替代的作用。腎活檢組織的檢查包括光鏡、免疫組織化學（熒光法）和電鏡觀察，現就筆者所在科多年來在腎穿組織免疫熒光及HE染色上的經驗總結報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎穿刺活檢組織200例，每例組織取1/3制作冰凍切片（將腎穿標本置于恒溫冷凍機的冷凍頭上，加少許OCT包埋劑，于冷室內－25 ℃冷凍切片，厚度要求3~4 μm），根據所需抗體切出相應數量的片子；其余2/3組織經腎穿刺組織專用脫水程序（10%中性福爾馬林固定45 min，75%酒精10 min，85%酒精10 min，置于90%酒精Ⅰ內4 ℃冰箱過夜，第2天于90%酒精Ⅱ 15 min，95%酒精Ⅰ 15 min，95%酒精Ⅱ 15 min，無水酒精Ⅰ 15 min，無水酒精Ⅱ 15 min，二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，石蠟Ⅰ 20 min，石蠟Ⅱ 30 min，石蠟Ⅲ 45 min）處理組織，石蠟包埋，切片厚2 μm，65 ℃烤箱內烤片1 h后，常規脫蠟至水，蒸餾水沖洗待用。冰凍切片及石蠟切片每例組織均切兩張，分AB兩組用于對照。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光法（直接法） （1）用冷風機將冰凍切片吹干。（2）A組：將pH 7.4的PBS液平鋪于切片上，浸泡2 min。甩干切片，將稀釋好的熒光抗體（稀釋30倍）滴于切片上，在37 ℃溫箱內孵育8~10 min。甩去切片上的熒光抗體，用pH 7.4的PBS液平鋪浸泡切片2 min。B組：用pH 7.4的PBS液沖洗切片3次，每次3 min。甩干切片，將稀釋好的熒光抗體（稀釋20倍）滴于切片上，在37 ℃溫箱內孵育30 min。甩去切片上的熒光抗體，用pH 7.4的PBS液沖洗切片3次，每次3 min［2］。（3）甩干切片，用紙巾擦去組織周邊的PBS液，滴加緩沖甘油封片。

1.2.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法 （1）石蠟切片常規脫蠟至水［3］。（2）A組：Harris蘇木素染色3 min，自來水洗1 min。1%鹽酸酒精分化20 s，自來水洗1 min。稀氨水（1%）返藍30 s，自來水洗1 min。95%酒精1 min，乙醇性伊紅液30 s，85%酒精脫水20 s，90%酒精30 s，95%酒精Ⅰ 1 min，95%酒精Ⅱ 1 min，100%酒精Ⅰ 1 min，100%酒精Ⅱ 1 min，取出用電風筒吹干，中性樹膠封片。B組［2］：Harris蘇木素染色5 min，自來水洗1 min。1%鹽酸酒精分化20 s，自來水洗1 min。稀氨水（1%）返藍30 s，自來水洗1 min。乙醇性伊紅染色30 s，自來水洗30 s，85%酒精脫水20 s，90%酒精30 s，95%酒精Ⅰ 1 min，95%酒精Ⅱ 1 min，100%酒精Ⅰ 2 min，100%酒精Ⅱ 2 min，二甲苯Ⅰ 2 min，二甲苯Ⅱ 2 min，二甲苯Ⅲ 2 min，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 免疫熒光法 在免疫復合物存在的情況下，AB兩組切片均可見免疫復合物熒光。但A組采用了浸泡切片的方法，減少了對切片上組織的沖洗力度，從而避免了B組常出現的掉片現象；且A組孵育時間較B組短，減少了由于熒光的自然衰退導致觀察結果假陰性。

2.2 蘇木素－伊紅（HE）染色法 AB兩組均呈細胞核紫藍色，細胞漿、基底膜、膠原纖維呈粉紅色。但A組在操作時間上大大縮短，同時A組在伊紅染液前加了一道95%酒精進行緩沖，避免了自來水對伊紅液的稀釋，延長了伊紅染液的使用時間［2］。在觀察效果相同的情況下，A組用電風筒吹干切片來替代二甲苯的使用，減少了操作時二甲苯對工作人員的傷害。

3 討論

為什么要推廣應用腎穿刺活檢，因為許多臨床分型方法不能明確診斷，在判斷預后等方面存在很多不足，而采用腎活檢有利于明確診斷、指導治療、判斷預后、探討臨床分型與病理分型的關系，也是提高腎臟病臨床與科研水平的重要手段之一［4］。

免疫熒光法是腎臟病理學中最重要的檢查方法，最好應用恒冷切片機。剛穿刺的腎組織新鮮，抗原保存良好，因此，在組織送檢方面要求嚴格。筆者所在科多年來都將組織放在滴有生理鹽水的小紗布墊上，連同紗墊置入干凈的小瓶，再把小瓶放進冰桶內進行送檢，這樣能最大限度地保存組織抗原。冰凍切片要求于冷室內-25 ℃進行，厚度要求3~4 μm。切片在冰凍固定液內固定后進行HE染色，并在光鏡下觀察有無腎小球，如有腎小球，則視所備抗體的種類，切出相應數量的切片。一般檢查項目有：常用羊抗人或兔抗人的免疫球蛋白（A、G、M、E）、抗γ和λ輕鏈，補體C3、C1q、C2、C4以及備解素。冰凍切片固定時間要求1 min以上，根據筆者所在科幾年的腎穿經驗，冰凍切片固定時間不夠時HE染色片中胞漿顯色不分明，增加閱片難度。

光鏡觀察是腎活檢最基本的方法，要求切片要薄，一般在2 μm左右，否則細胞組織重疊，導致誤診。蘇木素和伊紅染色方法，簡稱HE染色方法，是生物學和醫學的細胞與組織學最廣泛應用的染色方法，也是腎穿病理診斷中最為實用及簡便的方法。伊紅染液有兩種配制方法，一種為水溶性伊紅（伊紅Y 0.5~1 g，蒸餾水100 ml），另一種為乙醇性伊紅（伊紅Y 0.5~1 g，90%酒精100 ml）。剛開始時筆者所在科在HE染色方法中選用了水溶性伊紅進行細胞漿等染色，發現切片在伊紅液中無論上色有多深，經過快速水洗后組織內伊紅褪色嚴重，且上色極不均勻。之后筆者所在科改用了乙醇性伊紅且染色后不經水洗，此方法雖然克服了水溶性伊紅水洗后褪色明顯的問題，但因其染色前經過水洗，仍會有少量水份帶入伊紅液內使其不斷被稀釋，因此，為了達到最佳染色效果筆者只能不斷地更換伊紅液，增加了制片成本。為了減少試劑的浪費，筆者所在科在此方法上進行了多次摸索，最終在進行伊紅染色前增加了一道９５%酒精，使切片在經過水洗后入酒精進行緩沖，這樣不僅組織細胞上色穩定均勻，核漿對比明顯，且避免了伊紅液被稀釋浪費的問題。

參 考 文 獻

［1］ 鄒萬忠.腎臟病理與臨床.長沙：湖南科學技術出版社，1997：7.

［2］ 王伯沄，李玉松.腎活檢標本的制作技術，蘇木精伊紅染色方法//病理學技術.人民衛生出版社，2000：130－132，949－951.

［3］ 鄭燕璇，王曉鴻.石蠟切片脫蠟方式的比較.中國實用醫藥，2009，4（14）：211

［4］ 阿不都米吉提#8226;阿不都熱西提，帕夏古麗#8226;玉蘇普.急性腎損傷的病因及預后分析.中國醫學創新，2011，8（12）：163.

（收稿日期：2011-08-02）

（本文編輯：郎威）