木素過(guò)氧化物酶及乙二醛氧化酶在殼聚糖上的共固定化

摘 要:選取殼聚糖-戊二醛共價(jià)法對(duì)黃孢原毛平革菌所產(chǎn)的木素過(guò)氧化物酶(LiP)和乙二醛氧化酶(GLOX)同時(shí)進(jìn)行了共固定化研究，LiP和GLOX的酶活回收率分別達(dá)到了81.4%和45.2%。實(shí)驗(yàn)表明:采用先活化載體后共價(jià)結(jié)合酶的固定方法比活化載體-酶固定化同時(shí)進(jìn)行效果好;在選擇活化劑種類上，戊二醛優(yōu)于乙二醛和不加活化劑;最佳加酶量為30ml/0.4g載體;最佳戊二醛濃度為0.2%;戊二醛最佳固定化時(shí)間均為10h。

關(guān)鍵詞:木素過(guò)氧化物酶乙二醛氧化酶共固定化殼聚糖

中圖分類號(hào):Q814.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2011)08(c)-0114-02

引言

黃孢原毛平革菌是一種典型的白腐真菌。它能降解木質(zhì)素。其原因是它產(chǎn)生的胞外木質(zhì)素降解酶體系，該酶系的主要酶有木素過(guò)氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)，乙二醛氧化酶(glyoxal oxidase，GLOX)。LiP能催化氧化各種非酚類的底物，它是依賴于H2O2的氧化反應(yīng)。GLOX是黃孢原毛平革菌在產(chǎn)生木素過(guò)氧化物酶的同時(shí)，產(chǎn)生的一種胞外氧化酶，它可以氧化胞外培養(yǎng)液中的乙二醛和甲基乙二醛生成H2O2供Lip使用[1]。Chung[2]在研究LiP氧化苯酚時(shí)發(fā)現(xiàn):溶液中的H2O2的濃度高(400μmol/L)時(shí)，LiP的快速失活，原因是LiP的催化循環(huán)的中間體LiPⅡ與過(guò)量的H2O2反應(yīng)生成無(wú)活性的LiPШ。

Fred van de velde等人[3]用過(guò)氧化物酶/葡萄糖氧化酶雙酶共固定化系統(tǒng)進(jìn)行不對(duì)稱氧化反應(yīng)，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖來(lái)提供氧化劑H2O2。由于高濃度的H2O2會(huì)使過(guò)氧化物酶失活，原位生成H2O2可以控制H2O2在低位，很好地保護(hù)過(guò)氧化物酶的活性。本文用類似的思想共固定化木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶。該固定化雙酶體系可以控制乙二醛氧化酶原位產(chǎn)生的H2O2濃度在低位，從而保護(hù)木素過(guò)氧化物酶的酶活。

以殼聚糖為載體用共價(jià)法固定化酶是研究最活躍的酶固定化方法。由于殼聚糖不存在殘存的單體，故它作為酶載體較其它聚合物具有更大的優(yōu)越性[4]。

1材料與方法

1.1 酶液

由黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)培養(yǎng)得到粗酶液[5]，濾紙過(guò)濾除去菌絲，再經(jīng)凍溶法除多糖，超濾濃縮[6]約10倍后，4℃儲(chǔ)藏備用。測(cè)得GLOX酶活約為170U/L，LiP酶活約為3000U/L，蛋白質(zhì)含量約為1000μg/mL。

1.2 酶活力的測(cè)定和酶活二次回收率

參照文獻(xiàn)[7]。

1.3 殼聚糖載體的制備

用質(zhì)量濃度為5%的乙酸配制濃度為25 g/L的殼聚糖溶液，充分溶解或者在4℃冰箱放置過(guò)夜，制成透明膠液;在殼聚糖溶液中逐滴滴入濃度為10mol/L的NaOH溶液，同時(shí)劇烈攪拌，使殼聚糖凝膠析出;用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，即得殼聚糖凝膠。

1.4 共固定化方法

使用兩種方法進(jìn)行酶固定化:(1)在1g殼聚糖所制得的凝膠中先加入一定量的戊二醛，在4℃攪拌，活化若干小時(shí)，用pH為4.5的酒石酸緩沖液洗去多余戊二醛，抽濾;再加入一定量酶液，4℃攪拌12h，靜置過(guò)夜，用pH為4.5的酒石酸緩沖液洗去未固定的酶，抽濾，得固定化酶。(2)同時(shí)加入緩沖液、酶樣和一定濃度的戊二醛進(jìn)行處理，用pH為4.5的酒石酸緩沖液洗去未固定的酶及其它雜質(zhì)，抽濾，得固定化酶。

1.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用福林-酚法[8]。

2結(jié)果與討論

2.1 共固定化順序的選擇

分別用先活化載體后共價(jià)固定和活化載體與共價(jià)固定同時(shí)進(jìn)行兩種不同方法對(duì)GLOX進(jìn)行固定，即固定化方法(1)和(2)，結(jié)果(表1)所示。

由表1可見(jiàn)，若采用方法(2)，雙酶的酶活回收率和固定蛋白含量均明顯低于方法(1)，因此，采用先活化載體后共價(jià)固定法固定雙酶。

2.2 載體活化劑種類的確定

分別采用戊二醛、乙二醛活化殼聚糖載體，再用其固定雙酶，同時(shí)與不加活化劑直接用殼聚糖載體吸附固定雙酶相比較，結(jié)果（表2）所示。

由表2可見(jiàn)，以戊二醛活化載體后再固定雙酶的酶活回收率較乙二醛和直接吸附均要高，但乙二醛處理后的游離蛋白含量最低。我們發(fā)現(xiàn)，戊二醛最高，乙二醛次之，直接吸附最差。所以，以戊二醛活化載體后再共價(jià)固定雙酶的效果最佳。

2.3 加酶量對(duì)雙酶共固定化的影響

在0.4g殼聚糖所制得的載體中分別加入10，20，30，40，50ml酶液，其他條件同方法(1)，制備固定化酶，分析加酶量對(duì)雙酶固定化的影響，結(jié)果(圖1)所示。

由（圖1）可見(jiàn)，雙酶的固定化酶活都隨著加酶量的增加而增加;而酶活回收率卻隨加酶量的增加而減少。在加酶量為30ml/0.4g附近是載體活性結(jié)合位點(diǎn)的飽和點(diǎn)。綜上所述，加酶量不是越大越好，兼顧固定化酶活和酶活回收率，認(rèn)為加酶量取30 ml/0.4g較為合適。

2.4 戊二醛濃度對(duì)雙酶共固定化的影響

分別取0.4g殼聚糖凝膠與30ml不同濃度的戊二醛(0.0%～1.0%)溶液混合，攪拌反應(yīng)后靜置過(guò)夜，水洗，抽濾，制成固定化載體，再將其用于雙酶的共固定。結(jié)果如圖2所示。

由（圖2）可見(jiàn)，在戊二醛質(zhì)量濃度為0.2%時(shí)，雙酶的酶活回收率都達(dá)到最高。因此，戊二醛質(zhì)量濃度應(yīng)取為0.2%較為適合。

2.5 酶固定化時(shí)間的優(yōu)化

采用戊二醛濃度0.2%，載體活化時(shí)間為10h，再加入30ml酶液，酶固定化時(shí)間分別取4、6、8、10和12h，其它操作同方法(1)。結(jié)果（圖3）所示。

由（圖3）可知，10h后游離蛋白含量的減少量開(kāi)始減少，說(shuō)明可能固定10h左右固定化已趨于穩(wěn)定，因此，采用固定化的時(shí)間為10h較為合適。

3結(jié)語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了LiP和GLOX雙酶共固定在殼聚糖上的固定化條件，LiP和GLOX的酶活回收率分別達(dá)到了81.4%和45.2%。實(shí)驗(yàn)表明:采用先活化載體后共價(jià)固定方法為佳;選擇活化劑戊二醛;加酶量取30ml/0.4g較為合適;最佳戊二醛濃度為0.2%;戊二醛最佳酶固定化時(shí)間均可選用10h。

參考文獻(xiàn)

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