復方倍他米松抑制兔耳瘢痕增生與氧自由基作用的初步研究

[摘要] 目的 了解復方倍他米松局部注射對兔耳增生性瘢痕組織中丙二醛含量的影響，并探討其與氧自由基的關系。方法 新西蘭兔14只制作兔耳增生性瘢痕模型，正常兔耳皮膚組織標本8例；兔耳增生性瘢痕組織標本28例，隨機分為復方倍他米松組（10例）、生理鹽水組（10例）、空白對照組（8例）。術后6周予復方倍他米松（40 mg/ mL）分點注射于瘢痕樣組織內，每處2~3點，總量0.3~0.4 mL，每周1次，3次為一療程。術后9周取材，計數成纖維細胞，并測量瘢痕的相對增生厚度，測定丙二醛含量變化。結果 ①大體形態學變化：復方倍他米松部治療3周后，瘢痕顏色接近兔耳的正常膚色，略高出皮面，表面工整，觸之質軟。②組織學變化：與其他三組比較，復方倍他米松組膠原纖維多為平行排列，數量減少。③成纖維細胞密度與瘢痕增生指數變化：與其他三組比較，復方倍他米松組成纖維細胞密度增高（P＜0.05)，④丙二醛含量變化：與其他三組比較，復方倍他米松組丙二醛含量明顯增高（P＜0.05）； 結論 復方倍他米松局部注射兔耳創面引起兔耳增生性瘢痕組織中氧自由基水平升高。

[關鍵詞] 增生性瘢痕；復方倍他米松；氧自由基；細胞凋亡；成纖維細胞

[中圖分類號] R782.2[文獻標識碼] A[文章編號]1673-9701（2011）21-09-03

Inhibitory Effect of Triamcinolone Acetonide on Hypertrophic Scar and Oxygen Free Radicals in Rabbits

WU Xin min1LI Xia2 ZHOU Qinsheng1 MA Long3BAI Jing1 TAN Ge1

1.Department of Plastic Surgery， Fifth Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China; 2. Department of Anesthesiology， Fifth Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China; 3.The Reshaping Burns the Traumatology Department，Xinjiang Production and Construction Corps Hospital，Urumqi 830011，China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of triamcinolone acetonide on hypertrophic scar and oxygen free radicals in rabbits. Methods Eighteen New Zealand rabbits were used. 14 rabbits were selected randomly to construct animal models of hypertrophic scar on the ears. Another 4 rabbits（8 ears）were used as controls. 6 weeks after operation，the hypertrophic scar on the ears were randomly divided to receive intra-lesion injection of TA（n=10），or normal saline（n=10），or nothing( n=8，sham group）.9 weeks after operation，scar specimens were taken for scar thickness measurement，fibroblast counting under microscopy and MDA content detection by spectrophotometric method. Results ①3 weeks after TA treatment，the scar became very thin and soft with a similar color to normal skin and a smooth surface；②Histologic study showed the collagen fibers in TA group were reduced markedly and arranged parallelly；③Compared with normal skin，the fibroblast density-in，sham and saline groups increased significantly（P＜0.05），but the scar hypertrophic index was decreased dramatically in TA group（P＜0.05）；④The MDA content was highest in TA group（P＜0.05），followed by that in sham and saline groups（P＜0.05），It was lowest in normal control group（P＜0.05）.Conclusion The oxygen free radicals in the hypertrophic scar can be further increased by local injection of TA.

[Key words] Hypertrophic scar；Triamcinolone acetonide；Oxygen free radicals；Apoptosis；Fibroblast

氧自由基是一類化學性質非常活躍的原子或分子，參與不同類型細胞增殖與凋亡的調節。糖皮質激素治療病理性瘢痕已有數十年的歷史，糖皮質激素抑制瘢痕增生是否與氧自由基的作用有關，查閱國內外文獻學者報道不多。為此，我科參照文獻報道[1-2]制作兔耳增生性瘢痕模型，以了解復方倍他米松局部注射對兔耳增生性瘢痕組織中丙二醛含量的影響，并就復方倍他米松抑制兔耳增生性瘢痕的作用與氧自由基的關系進行了探討。

1#8195;材料與方法

1.1#8195;實驗動物、主要儀器與試劑

新西蘭大白兔18只（新疆醫科大學動物實驗中心提供），12~18個月齡，清潔級，飼養環境：室內單籠飼養，溫度17~25℃，相對濕度45％~65%，兔顆粒飼料飼養（新疆醫科大學動物實驗中心提供）。兔耳健全，雌雄不拘，重量約2.0~3.5 kg。 B20- Tek1N超級酶標儀、Eppendorf冷凍離心機、梅特勒電子天平、Millipore純水儀（美國Millipore)、 Forma超低溫冰箱， Olympus顯微鏡，Tomos微量移液器、勻漿儀。復方倍他米松注射液。總蛋白測試盒，微量丙二醛測試盒，3％戊巴比妥鈉。

1.2#8195;兔耳增生性癱痕模型的制作

實驗于2008年12月~2009年10月 。新西蘭兔18只分籠普食飼養，適應性飼養1周后，參照文獻[1-2]制作兔耳增生性瘢痕模型。動物稱重后固定，以3％戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，在兔耳腹側中段沿長軸避開可見血管，切開皮膚全層，在皮膚與軟骨之間銳性剝離，去除兔耳腹側全層皮膚，制作1.0 cm×1.0 cm大小創面4~5個，創面間隔1.0 cm以上（圖1)，止血后用無菌紗布包扎，清醒后自由進食。術后1d創面暴露，待其自行愈合，約4周后形成瘢痕樣組織。

1.3#8195;實驗分組

所有標本均取自18只新西蘭兔耳組織，共36例。其中，正常兔耳皮膚組織標本8例（正常對照組）；兔耳增生性瘢痕組織標本28例，隨機分為復方倍他米松組（10例）、生理鹽水組（10例）、空白對照組（8例） 4組動物月齡、雌雄比較差異均無統計學意義（P＞0.05)。參照文獻[1-3]，結合預實驗摸索，復方倍他米松于術后6周將復方倍他米松液（40 mg/mL）分點注射于兔耳瘢痕樣組織內，每處2~3點，總量0.3~0.4 mL，注射后瘢痕塊局部蒼白。生理鹽水組應用生理鹽水進行注射，劑量、注射方法同前。每周1次，3次為一療程。

制模術后9周采集各組標本，用蒸餾水反復沖洗，去除表面血跡后，每份標本一分為二，一份作病理檢查，一份置于清潔聚乙烯試管中加塞封閉，-70℃冰箱凍存待檢。

1.4#8195;形態學觀察和檢測指標

①觀察瘢痕增生情況；②在顯微鏡下計數實驗各組成纖維細胞；③HE染色切片在顯微鏡下用顯微測量標尺測量瘢痕的相對增生厚度，以計算各組瘢痕增生指數[2]。見圖1～2.

圖1 術后即日 圖2 術后第9周

1.5#8195;丙二醛測定

組織稱重后，冰浴上融化，小剪刀剪碎，按重量體積比加人9倍生理鹽水，超聲勻漿儀冰浴上勻漿，制成10％組織勻漿液，4℃， 3000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒所附說明書測定丙二醛與總蛋白含量。用比濃度表示丙二醛含量（nmol/mgprot）。

1.6#8195;統計學處理

所得數據輸入SPSS11.5軟件包進行統計分析，以均數±標準差表示。各組數據比較采用單因素方差分析。

2#8195;結果

2.1#8195;大體形態學變化

術后30d創面上皮化，有高出周圍正常皮膚的瘢痕形成。術后6~8周瘢痕增生顯著，色紅、質硬，其增生范圍不超過原創緣 ;復方倍他米松局部治療3周后，瘢痕顏色接近兔耳正常膚色，略高出皮面，表面平整，觸之質軟。

2.2#8195;組織學變化

HE染色顯示，兔耳增生性瘢痕空白對照組、生理鹽水組真皮層中含大量排列致密、粗大的膠原纖維，排列紊亂，呈漩渦狀或結節狀，可見大量成纖維細胞。與空白對照組、生理鹽水組比較，復方倍他米松組膠原纖維多為平行排列，成纖維細胞數量減少。

2.3#8195;成纖維細胞密度與瘢痕增生指數變化

與正常皮膚組比較，空白對照組以及生理鹽水組成纖維細胞密度增高（ P＜0.05 )，而復方倍他米松組差異無統計學意義（P＞0.05 )；生理鹽水組與空白對照組間成纖維細胞密度及瘢痕增生指數比較差異無統計學意義（P＞0.05)；與空白對照組、生理鹽水組比較，復方倍他米松組成纖維細胞密度及瘢痕增生指數顯著降低，見表1 。

2.4#8195;丙二醛含量變化

復方倍他米松組丙二醛含量明顯增高（P＜0.05)；生理鹽水組與空白對照組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常皮膚組比較，空白對照組以及生理鹽水組丙二醛含量增高，見表2。

3#8195;討論

我們參照文獻[1-2]制作了兔耳增生性瘢痕模型，結果顯示大體形態學變化、組織學變化以及成纖維細胞密度與瘢痕增生指數變化符合文獻報道[1-2]，表明動物模型復制成功。同時，我們觀察發現，應用復方倍他米松局部治療3周后，對兔耳增生性瘢痕具有很好的抑制作用。糖皮質激素治療瘢痕的作用可能是通過抑制瘢痕組織中成纖維細胞增殖及其生物合成并促進成纖維細胞凋亡而實現[3-5]。但激素誘導成纖維細胞凋亡的途徑尚需進一步研究，這對今后尋求瘢痕治療的新措施可能有所幫助。

研究發現，活性氧具有重要的信號作用，特別是一定水平的超氧陰離子（O2-）或過氧化氫（H2O2)能夠刺激不同類型細胞的增殖[6-7]，然而活性氧的過度產生會損傷DNA、蛋白和脂質，誘導細胞凋亡甚至引起壞死[8]，這些相對立的研究結果表明活性氧具有雙相作用[9]。丙二醛是氧自由基與生物膜中的多價不飽和脂肪酸作用，發生脂質過氧化反應生成的終產物，可用作間接檢測氧自由基水平的指標。國內學者的研究證實，氧在創傷愈合中起著重要作用。在創面的肉芽組織內，缺氧環境刺激巨噬細胞產生生長因子，促進成纖維細胞合成血管內皮基質。在我們的實驗中，空白對照組比正常皮膚組的成纖維細胞密度和丙二醛含量明顯增高（P＜0.05)，提示兔耳瘢痕增生塊的發生可能與氧自由基適度增加刺激成纖維細胞增殖有關。同時我們也發現，與空白對照組、生理鹽水組比較，復方倍他米松組成纖維細胞密度顯著降低（P＜0.05)，而丙二醛含量明顯增加（P＜0.05)。這可能是因為復方倍他米松局部注射誘發兔耳瘢痕增生塊內氧自由基進一步產生從而誘導成纖維細胞凋亡，進而引起成纖維細胞密度降低。已有研究表明[10]，復方倍他米松局部注射能夠抑制增生性瘢痕局部小血管增生，這將加重組織缺血、缺氧，并因此可能引起瘢痕局部黃嘌呤氧化酶途徑產生的活性氧增多[11]。

綜上所述，復方倍他米松局部注射引起兔耳增生性瘢痕組織中氧自由基水平進一步升高，通過對瘢痕局部氧自由基水平的調節以誘導成纖維細胞凋亡可能有助于防治瘢痕過度增生，但尚需深入研究以獲取更多依據加以驗證。

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（收稿日期：2010-08-18）

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