阿那曲唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥芳香化酶P450\\雌二醇及雌激素受體的影響

[摘要] 目的 探討阿那曲唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥（EMs）患者細(xì)胞色素芳香化酶P450(P450arom)、雌二醇(E2)和雌激素受體（ER）的影響。方法 子宮內(nèi)膜異位癥患者20例采用阿那曲唑治療3個(gè)月為治療組，子宮內(nèi)膜異位癥未采取藥物治療的20例為對(duì)照組， 用放射免疫法檢測(cè)血清中E2水平，用免疫組化方法檢測(cè)兩組患者在位內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜組織中P450arom、ER的表達(dá)。結(jié)果 治療組與對(duì)照組相比血循環(huán)中E2、P450arom 和ER表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論 阿那曲唑治療EMs，可能通過降低血E2，減少異位內(nèi)膜的P450arom 和ER表達(dá)而起到使異位內(nèi)膜病灶萎縮的作用。

[關(guān)鍵詞] 芳香化酶抑制劑；子宮內(nèi)膜異位癥；免疫組化方法；細(xì)胞色素芳香化酶P450；雌激素受體；雌二醇

[中圖分類號(hào)]R 711.71[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2011）25-54-03

Affection of Serum E2，Endometrial ER and P450arom Expression in Patients with Endometriosis after Treatment with Anastrozole

HUANG QiusuiHOU Xiaohong

Department of Obstetrics and Gynecology，NO.2 Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the affection of serum estradiol （E2），endometrial aromatase cytochrome P450（P450arom） and estrogen receptor(ER) expression in patients with endometriosis after treatment with anastrozole. MethodsTwenty cases of endometriosis with anastrozole treatment for 3 months and 20 cases of endometriosis control group with no treatment was measured by radioimmunoassay analyses of serum E2， imunohistochemical analyses of the endometrial expression of P450arom and ER. ResultsSerum E2， the expression level of P450arom、ER was decreased in the study group compared with the control group. ConclusionAnastrozole treats endometriosis by the ways of reducing serum E2 and decreacing the expression o f P450arom and ER in endometrium.

[Key words] Aromatase inhibitor ；Endometriosis; Imunohistochemical analyses; Aromatase cytochrome P450； Estrogen receptor; Estradiol

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦科的常見病，雖然生物學(xué)行為為良性，但具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和種植生長的惡性行為，近年來該病的發(fā)病率具有明顯上升的趨勢(shì)。EMs 是雌激素依賴性疾病， 在此病變過程中， 雌激素及其受體(estrogen receptor， ER) 、雌激素合成限速酶——細(xì)胞色素芳香化酶(aromatase cytochrome P450，P450arom) 發(fā)揮重要作用。阿那曲唑是第三代芳香化酶抑制劑，它通過抑制雌激素合成過程中的限速酶芳香化酶P450而起治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用。本研究通過研究阿那曲唑治療子宮內(nèi)膜異位癥后血清中雌二醇（estradiol ，E2）、子宮內(nèi)膜中ER和P450arom 表達(dá)的變化， 以探討阿那曲唑治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制及判斷其療效。

1對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2007年11月～2008年10月在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦科就診的子宮內(nèi)膜異位癥患者40例，子宮內(nèi)膜異位癥根據(jù)臨床所見及術(shù)后病理檢查確診。將40例患者隨機(jī)分成治療組與對(duì)照組各20例，治療組采用阿那曲唑口服，1mg/d，共3個(gè)月；對(duì)照組未采取任何藥物治療。入選對(duì)象為育齡期婦女， 無內(nèi)外科重要臟器疾患，至少3個(gè)月內(nèi)未接受激素類藥物治療。兩組在年齡、體重指數(shù)（Body massindex， BMI） 方面具有可比性 （P＞0.05）。

1. 2觀察指標(biāo)

ER為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒。P450arom 信號(hào)存在于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞漿中， 染色為淡黃色或棕黃色或褐黃色。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集治療組患者術(shù)前取空腹肘靜脈血2mL， 常溫下靜置1h，離心10min， 取上清液， - 70℃保存；于術(shù)中取異位囊腫的囊壁和在位內(nèi)膜組織， 離體后投入4%多聚甲醛中固定。對(duì)照組同上取靜脈血2mL，并留取部分子宮內(nèi)膜組織， 離體后投入4%多聚甲醛中固定。

1.3.2測(cè)定方法①采用放射免疫法檢測(cè)血清中E2水平: E2放免試劑盒由天津德普公司提供，批內(nèi)差異和批間差異分別＜10%和＜ 15%，E2水平的測(cè)定按說明書采用放免法測(cè)定。②采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中ER的表達(dá): 兔抗人雌激素多克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。SP試劑盒購于福建邁新生物制品公司。采用石蠟包埋組織標(biāo)本， 切片厚4μm， 常規(guī)SP免疫組化， 用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照，蘇木素復(fù)染。③采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中P450arom的表達(dá): 標(biāo)本采用免疫組化鏈酶卵白素蛋白酶SP法測(cè)定芳香化酶P450的表達(dá)。PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照，已知陽性片為陽性對(duì)照。兔抗人芳香化酶多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4結(jié)果判定

ER 免疫組化結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn): ER陽性為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒；P450arom 陽性為子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或淡黃色顆粒。ER陽性細(xì)胞所占百分比即為ER標(biāo)記指數(shù)( ER labeling index， ER LI) ，按ER LI并參考著色強(qiáng)度確定分級(jí)如下: 0% 計(jì)為0 分， 1%～25%為1 分， 26%～50% 為2 分， ＞50%為3 分；按染色的強(qiáng)度計(jì)分， 淡黃色或淡棕色計(jì)為1 分， 棕褐色計(jì)2 分， 深棕褐色計(jì)3 分。以上兩者相加總分作為計(jì)分方式。P450arom的計(jì)分方式同ER。

1.5#8195;統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 臨床資料和血清中E2 水平采用兩樣本t檢驗(yàn)， 用（χ±s）表示；免疫組化數(shù)據(jù)采用χ2和秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1#8195;血清中E2 水平的測(cè)定

治療組血清中E2值為（38.23 ±15.64） pg/mL，對(duì)照組血清中E2值為（65.49±18.65）pg/ mL，治療組與對(duì)照組相比E2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2#8195;內(nèi)膜組織中ER和P450arom的表達(dá)

ER為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒。治療組在位子宮內(nèi)膜ER表達(dá)強(qiáng)度均值為（4.63±1.82）， 明顯低于對(duì)照組的表達(dá)均值（15.70±3.17）（P＜0.05） 。陽性人數(shù)百分比治療組為40%，對(duì)照組為100% ， 兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。治療組的異位子宮內(nèi)膜ER表達(dá)強(qiáng)度均值（3.67±2.02）， 明顯低于對(duì)照組表達(dá)均值為（13.80±2. 69） （P＜0.01）。異位內(nèi)膜陽性人數(shù)百分比治療組為25%，對(duì)照組為95%， 兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。P450arom主要在內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)， 內(nèi)膜間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞核上少有表達(dá)。治療組在位子宮內(nèi)膜P450arom表達(dá)強(qiáng)度均值為（4.24±1.64）， 明顯低于對(duì)照組的表達(dá)均值（17.80±3.35） （ P＜0.01）。陽性人數(shù)百分比治療組為25% ，對(duì)照組為90%，兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。治療組異位子宮內(nèi)膜P450arom表達(dá)強(qiáng)度均值為（3.31±1.48）， 明顯低于對(duì)照組的表達(dá)均值（14.50±2. 84）（P＜0.01）。陽性人數(shù)百分比治療組為30%，對(duì)照組為75% ，兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01），見表1。

表1子宮內(nèi)膜組織中ER和P450arom 的表達(dá)（χ±s，n＝20 ）

組別 陽性數(shù)（%）P450arom 陽性數(shù)（%）ER

對(duì)照組

在位內(nèi)膜 18( 90） 17.80±3.35 20（100）15.70±3.17

異位內(nèi)膜15（75）14.50±2.84 19（95）13.80±2.69

治療組

在位內(nèi)膜5( 25）4.24±1.64*8 （40）4.63±1.82*

異位內(nèi)膜 6（30） 3.31±1.48* 5（25）3.67±2.02*

注: *P＜0.01

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科常見病，常侵蝕性破壞周圍組織，如卵巢、腹膜、直腸、膀胱等，引起痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、不孕等癥狀。近年來該病的發(fā)病率具有明顯上升的趨勢(shì)，已占婦科疾病10.0％以上[1]，同時(shí)其誘發(fā)的不孕癥發(fā)生率高達(dá)30％～40％，給婦女的身心健康帶來極大的危害。目前EMs手術(shù)或藥物治療后復(fù)發(fā)率仍較高，研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療方法成為婦產(chǎn)科醫(yī)生的一大難題。

細(xì)胞色素芳香化酶P450是細(xì)胞色素的一種 能催化C-19雄性甾體激素形成雌酮（E1）和雌二醇（E2），是雌激素合成的限速酶。芳香化酶在子宮內(nèi)膜異位癥的高表達(dá)，導(dǎo)致局部雌激素濃度的上升，是子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病原因之一，該理論為芳香化酶抑制劑治療子宮內(nèi)膜異位癥提供了依據(jù)。芳香化酶抑制劑通過與亞鐵血紅素中的鐵原子結(jié)合，與內(nèi)源性底物競(jìng)爭(zhēng)芳香化酶的活性位點(diǎn)，從而可逆地抑制酶的活性，由此降低局部組織中的雌激素水平。第3代芳香化酶抑制劑阿那曲唑，具有強(qiáng)效的芳香化酶抑制作用，在血循環(huán)中和腫瘤組織內(nèi)部能達(dá)到近完全的雌激素抑制，從而抑制異位的子宮內(nèi)膜生長。本研究中治療組在位子宮內(nèi)膜P450arom表達(dá)強(qiáng)度均值為（4.24±1.64）， 明顯低于對(duì)照組的表達(dá)均值（17.80±3.35）。陽性人數(shù)百分比治療組為25% ，對(duì)照組為90% ， 兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01） 。本研究中阿那曲唑是通過抑制芳香化酶P450而起到治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用。

EMs的發(fā)生發(fā)展與雌激素密切相關(guān)，是一種雌激素依賴疾病[2]。EMs多見于生育年齡婦女，妊娠、絕經(jīng)后或切除雙側(cè)卵巢后異位內(nèi)膜組織可逐漸吸收，使用性激素抑制劑可阻止該病的發(fā)展。異位內(nèi)膜可以自分泌雌激素，存在自分泌正反饋機(jī)制，導(dǎo)致異位病灶局部產(chǎn)生高水平的雌激素。而雌激素對(duì)ER合成有正向調(diào)節(jié)作用，升高的雌激素和正向調(diào)節(jié)升高后的ER結(jié)合后又進(jìn)一步促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜的生長。本研究中治療組與對(duì)照組相比血清中E2 水平明顯降低。因此，阿那曲唑用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，其機(jī)制之一可能是通過降低了血循環(huán)中的E2及抑制異位內(nèi)膜局部雌激素分泌而起到使子宮內(nèi)膜萎縮的作用。

Kitawaki等[3]研究證實(shí)EMs是雌激素依賴性疾病，異位內(nèi)膜的生長和侵襲依賴于雌激素， 雌激素通過雌激素受體（ER）起作用。20世紀(jì)90年代以前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為雌激素是通過單一受體起作用，1996年Gustsfsson JA發(fā)現(xiàn)了ERβ亞型。ERα和ERβ亞型在結(jié)構(gòu)上、靶器官的分布及轉(zhuǎn)錄后活化強(qiáng)度存在不同的差異，對(duì)EMs發(fā)生發(fā)展起重要作用。對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的研究中發(fā)現(xiàn)， ERα在在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中都有表達(dá)， 而ERβ主要是異位病灶中強(qiáng)表達(dá)[4，5]。ER表達(dá)增加， 可能會(huì)增加異位內(nèi)膜局部雌激素的產(chǎn)生及對(duì)激素敏感性的增加，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥病灶的生長。鄭輝等[6]研究表明，異位內(nèi)膜上絕對(duì)或相對(duì)減少的孕激素受體（progesterone receptor，PR）可能導(dǎo)致其降低或失去對(duì)雌激素控制的反應(yīng)性，而相對(duì)較高的ER 可能導(dǎo)致雌激素為主的環(huán)境，在EMs的發(fā)展中起作用。本研究治療組的在位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜ER表達(dá)強(qiáng)度均值均明顯低于對(duì)照組表達(dá)均值（P＜0.01） ，且兩者的陽性人數(shù)百分比治療組均比對(duì)照組為小，兩組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。因此，阿那曲唑治療子宮內(nèi)膜異位癥不但降低了血循環(huán)雌激素，還減少了在位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜ER的表達(dá)，使雌激素和其受體的結(jié)合進(jìn)一步減少，而起到治療子宮內(nèi)膜異位癥的目的。

從本研究可以看出，阿那曲唑治療子宮內(nèi)膜異位癥降低了血循環(huán)中E2，并減少了在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜P450、ER的表達(dá)。因此，對(duì)E2、P450和ER的聯(lián)合檢查，不但可以作為EMs的診斷指標(biāo)[7-9]，作為今后藥物治療EMs的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在EMs的發(fā)病機(jī)制中， Sampson經(jīng)血逆流理論被大家廣泛接受。郎景和教授[10]對(duì)在位子宮內(nèi)膜在EMs發(fā)病中的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，認(rèn)為在位內(nèi)膜的內(nèi)在特性是決定女性逆流經(jīng)血中的內(nèi)膜碎片能否在宮腔以外部位繼續(xù)生長的關(guān)鍵，即“在位內(nèi)膜決定論”。即EM的發(fā)病與否主要取決于患者在位內(nèi)膜本身的特性，而非異位內(nèi)膜的生長環(huán)境。阿那曲唑治療子宮內(nèi)膜異位癥是否通過改變EMs在位內(nèi)膜的特性，抑或只是通過阻斷EMs發(fā)病機(jī)制中某一環(huán)節(jié)，有待于我們今后進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2011-06-09）