大鼠慢性腦低灌注模型再灌注腦組織HIF-1α\\VEGF表達的意義

【摘要】 目的 觀察缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）在大鼠慢性腦低灌注后再灌注腦組織中表達的意義。方法 SPF級雄性SD大鼠24只，隨機分為兩組，假手術組（S組）和再灌注組（R組），每組12只。建立大鼠慢性腦缺血模型，6周后恢復血流灌注，于再灌注前即刻（R₀）、再灌注1 h（R₁）、24 h（R₂）及72 h（R₃）行激光多普勒血流探測儀（LDPI），檢測腦皮層血流灌注量；其后采用qRT-PCR法，檢測HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA在腦組織中的表達。結果 大鼠慢性腦缺血再灌注后1 h，實驗側腦皮層血流灌注量較對側下降（73.12±26.75）%，再灌注后24 h腦皮層血流灌注量有所恢復，72 h仍未達到基線水平；與S組比較，各組大鼠再灌注后的不同時點HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA均表達增高（P<0.05）。結論 HIF-1α、VEGF在大鼠慢性腦低灌注再灌注后表達上調，參與大鼠腦血管增殖及活性增強的病理過程，改善腦血流動力學。

【關鍵詞】 再灌注； 腦； 缺氧誘導因子-1α； 血管內皮生長因子； 大鼠

Expressions of HIF-1α and VEGF in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion JIANG Nan，XIAO Liang-can，RONG Jian. First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

【Abstract】 Objective To observe the expressions of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion. Methods 24 healthy SD rats were randomly divided into Sham group（group S，n12）and reperfusion group （group R，n12）.The modified chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion （CCH） animal model of rat had been established base on the Yassari'study work. The blood flow perfusion of cerebral pallium was detected by using a Lasser Doppler Perfusion Imager（LDPI） before reperfusion （R₀），1h after reperfusion （R₁），24h after reperfusion （R₂） and 72h after reperfusion （R₃）. Rats were sacrificed at R₃ after reperfusion，respectively. The expressions of HIF-1α and VEGF gene were inspected at molecular levels with qRT-PCR technique. Results The estimated reduction of the cerebral blood flow perfusion was （73.12±26.75）% at AVF side compared with the values inspected at the opposite side at R₁.The cerebral blood flow perfusion recovered partially at R₂，but did not reach to the baseline level at R₃. Compared with group S，the expressions of HIF-1α and VEGF mRNA in group R after reperfusion were significantly increased （P<0.05）. Conclusion The expressions of HIF-1α and VEGF were upregulation in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion. HIF-1α maybe contral the expression of VEGF and enhance vascular proliferation activity in the rats with chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion.

【Key words】 Reperfusion； Brain； Hypoxia-inducible factor-1α； vascular endothelial growth factor； Rat

腦慢性低灌注缺血后可在敏感腦區觀察到神經元凋亡、腫脹，神經膠質細胞增生、小血管比例增多及血腦屏障結構破壞等病理改變^［1］，這種改變與腦慢性低灌注后腦組織血流灌注下降密切相關。有研究發現，急性短暫全腦缺血再灌注后，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）可以通過靶基因促進血管內皮生長因子（VEGF）表達增加，VEGF是血管內皮細胞特異性有絲分裂原，在多種生理和病理條件下促進新生血管的生成從而改善腦血流動力學^［2，3］。本研究擬探討慢性腦缺血再灌注狀態下，HIF-1α和VEGF在腦組織中的表達意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組與方法 健康清潔級雄性SD大鼠24只，體重250～270 g，由中山大學實驗動物中心提供。隨機分為兩組，假手術組（S組）和再灌注組（R組），各12例。參照Yassari等^［4］方法并改良制備大鼠慢性腦缺血再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛1 ml/kg麻醉下，將再灌注組大鼠仰臥于手術臺上，頸前區前正中逐層切開皮膚，分離左、右側頸外靜脈及頸總動脈，顯微鏡下采用11.0血管縫合尼龍線將右側頸總動脈遠心端同右頸外靜脈近心端吻合，并同時阻斷雙側頸外靜脈。在制作模型期間，小動物超聲儀（BIOPAC SYSTEMS MP150）監測大鼠對側頸總動脈血流峰值流速，吻合部位開放后血流峰值流速下降>25%，提示產生明顯的盜血效應，即缺血成功。缺血6周后，腹腔注射10%水合氯醛1 ml/kg，麻醉下恢復血流灌注，采用可控性保溫墊維持直腸溫37 ℃，維持實驗室溫度24 ℃～25 ℃，濕度60%。

1.2 腦皮層血流灌注量檢測 將麻醉后的大鼠固定于腦立體定位儀上開顱，顱骨窗位于冠狀縫和人字縫之間，大小約5 mm×6 mm。于再灌注前即刻（R₀）為基礎狀態、再灌注1 h（R₁）、24 h（R₂）及72 h（R₃）時點，各組隨機取6只大鼠，采用PeriScan PIM 3激光多普勒血流灌注成像儀（Perimed公司，瑞典），以低功率激光束連續掃描已暴露的腦窗皮層測量區域和矢狀縫中點左右方各1.5 mm點。LDPI激光波長為670 nm，采用NR掃描模式，步長3 mm，掃描頭高度在15～30 cm，掃描面積4 cm×4 cm，記錄掃描到的面積血流灌注量和目標點血流灌注量。測量數值單位為PU（Perfusion Unit），其值越大代表皮層血流及灌注越強。檢測數據及圖像直接儲存在電腦硬盤，應用LDPI win 3.1軟件分析，處理結果導入Excel 2000 用于對比分析^［5，6］。

1.3 熒光RT-PCR檢測HIF-1α、VEGF-mRNA表達 取各組大鼠右側半球額頂區皮質，約1 mm×1 mm×2 mm大小。按Trizol試劑說明提取組織總RNA；使用逆轉錄試劑盒（Promega公司），按操作說明合成cDNA；以cDNA為模板進行PCR擴增。HIF-1α引物：上游5' tatctgaaagccctggatgg 3'，下游5' tgggccatttctgtgtgtaa 3'； VEGF 引物：上游5' gcccatgaagtggtgaagtt 3'，下游5' actccagggcttcattattg 3'。RT-PCR操作按試劑盒說明進行。PCR條件：95 ℃ 1 min，60 ℃ 1.5 min，72 ℃ 3 min，40個循環后，72 ℃延伸15 min。PCR產物以熒光TaqMan的方法檢測，將40個循環所測得基線水平熒光強度的標準偏差的10倍設為CT值（cycle threshold，即每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數），應用比較Ct法進行相對定量。在RT-PCR的條件下，經過內標基因的均一化處理后，推導出目標基因的相對定量為2-ΔΔCt，即目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于未經處理的樣本的倍數來表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與S組比較，R₀組雙側大腦皮層血流灌注量差異無統計學意義（P>0.05）；R₁組可見到實驗側大腦皮層灌注量較對側下降約（73.12±26.75）%，差異有統計學意義（P<0.05）；R₂組及R₃組雖然可見到實驗側腦灌注量有所回升（516.43±156.21） PU，但與R₁組（478.69±136.11）PU比較，差異無統計學意義（P>0.05）；而R₃組的實驗側相比對側血流下降比率仍為（74.46±27.68）%，差異有統計學意義（P<0.05），說明即使腦皮層血流灌注恢復72 h，原已形成的腦低灌注狀態也只是得到部分恢復，見表1。

HIF-1α在S組有微弱表達，與S組比較，再灌注后的各組HIF-1α表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與S組比較，VEGF的表達在R₀組已經有顯著增高，R₁組表達下調，R₃組表達水平回升。與S組比較，HIF-1α和 VEGF-mRNA在R₀組、R₁組、R₂組和R₃組表達均顯著增高，并呈現動態變化，說明它們可能參與了慢性腦缺血再灌注前后的病理生理過程，見表2。

表1 各組大鼠腦血流灌注量比較 （n6，x±s，PU）

注：與S組比較，^*P<0.05；與R₀組比較，^△P<0.05；與實驗側比較，^#P<0.05

表2 各組大鼠HIF-1α、VEGF mRNA表達水平的比較（皮層下及海馬區）（n6，x±s）

注：與S組比較，^*P<0.05；與R₀組比較，^△P<0.05

3 討論

缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）可以通過靶基因促進血管內皮生長因子（VEGF）表達增加，從而促進新生血管的生成，改善腦血流動力學^［2，3］。但慢性腦低灌注狀態能否有效地誘導促血管生長因子的表達，尚缺乏深入研究。激光多普勒血流灌注成像系統（LDPI）可連續、實時檢測腦皮層血流灌注量，通過對再灌注后腦皮層HIF-1α和VEGF變化的定量測定，可進一步研究慢性腦低灌注后再灌注血流動力學改變及HIF-1α和VEGF變化的關系。

本研究采用經典的右側CCA與EJV端端吻合AVF建立大鼠CCH模型，實驗中采用小動物超聲檢測對側CCA流速，發現在AVF開放前后血流峰值流速下降約34%，MAP下降接近20%，這一結果同既往研究資料相似^［7～9］。研究中應用PeriScan PIM 3激光多普勒血流圖像儀（Laser Doppler Perfusion Imager，LDPI；瑞典PERIMED公司生產），檢測大鼠開顱后皮層血流的變化，結果發現大鼠AVF側腦皮層血流在AVF建立后下降約30%左右，6周后開放AVF，腦皮層血流有所恢復，但未達到基線水平。與S組比較，再灌注前即刻的雙側大腦皮層血流灌注量無明顯差異；再灌注1 h可見到實驗側大腦皮層灌注量明顯下降；此后再灌注的24及72 h雖然可見到實驗側腦灌注量有所回升，但與再灌注前相比，下降比率仍有顯著差異，說明即使腦皮層血流灌注恢復72 h，原已形成的腦低灌注狀態也只是得到部分恢復。這與筆者以往的研究結果相似^［6］，提示慢性低灌注性腦缺血再灌注后72 h內，腦血流灌注量仍然是持續低灌注狀態。

本研究中，HIF-1α在S組有微弱表達，與S組比較，再灌注后各時間點的HIF-1α表達均顯著升高。與S組比較，VEGF的表達在再灌注前已經有顯著增高，再灌注后1 h表達下調，再灌注后72 h表達水平回升至再灌注前水平。與S組比較，HIF-1α和 VEGF-mRNA在各組中的表達呈現動態變化，說明它們可能參與了慢性腦缺血再灌注前后的病理生理過程，見表2。結果提示，除了慢性缺血缺氧狀態下HIF-1α表達誘導VEGF增加外，腦血流動力學異?？赡苁菍е麓傺苌L因子表達的重要因素^［10］。

綜上所述，HIF-1α可能調控VEGF在大鼠慢性腦缺血再灌注后腦組織中的表達上調，參與大鼠腦血管增殖及活性增強的病理過程，改善腦血流動力學。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-09-13）

（本文編輯：車艷）