微環(huán)境對(duì)食管上皮細(xì)胞增殖分化的影響

【關(guān)鍵詞】 微環(huán)境； 食管上皮細(xì)胞

食管疾病的發(fā)生已成為危害人類健康的重要因素，每年有大量的患者需進(jìn)行手術(shù)治療。而手術(shù)治療的主要方式多是切除食管或用自身的其他組織器官進(jìn)行重建。其缺點(diǎn)是手術(shù)創(chuàng)傷大，操作復(fù)雜，術(shù)后并發(fā)癥多。因此組織工程食管日益顯現(xiàn)出其存在的必要性。組織工程食管的基本原理是將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增所得的自體細(xì)胞，種植在組織相容性好的可降解支架上，進(jìn)行共同培養(yǎng)，再植入體內(nèi)相應(yīng)位置，逐步形成在結(jié)構(gòu)功能上與自體組織相似的人工食管，但干細(xì)胞必須分化為上皮細(xì)胞才有價(jià)值。細(xì)胞的分化方向與微環(huán)境“壁龕”密切相關(guān)^［1］。微環(huán)境包括細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、生理激素、離子濃度、O₂濃度等。本文就微環(huán)境對(duì)組織工程中食管上皮細(xì)胞增殖分化的影響作一簡(jiǎn)要綜述。

1 細(xì)胞因子的影響

1.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是一種分子量為40～45 kD的分泌性糖蛋白，編碼人類VEGF的基因位于染色體6p21.3上，該基因全長(zhǎng)24 kb。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)血管內(nèi)皮的增殖，血管構(gòu)建的作用較強(qiáng)，且特異性高，VEGF還可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性^［2］。VEGF發(fā)揮作用主要依賴其受體的存在。其中VEGFR1和VEGFR2是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性酪氨酸激酶蛋白受體，而VEGFR3主要在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)^［3］。由此可見(jiàn)，VEGF在干細(xì)胞向食管上皮誘導(dǎo)分化過(guò)程中有一定的意義。首先，VEGF可以促進(jìn)組織工程食管中微血管的生成，并增加其通透性；其次，促進(jìn)淋巴管的形成。以上兩者的作用，創(chuàng)造出更接近于人體食管的微環(huán)境，有利于食管上皮細(xì)胞的增殖分化。

1.2 表皮生長(zhǎng)因子 表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是一種廣泛存在于各種組織體液中的53個(gè)氨基酸組成的促有絲分裂的多肽，可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，包括上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞等^［4］。EGF在體外可刺激角化細(xì)胞分裂，在體內(nèi)可促進(jìn)上皮的再生^［5］。許多文獻(xiàn)報(bào)道，干細(xì)胞向食管上皮分化中出現(xiàn)分化消失現(xiàn)象，原因可能與培養(yǎng)基血清中的轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等因子抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，但刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)^［6］。成纖維細(xì)胞的大量產(chǎn)生有有利的一面，也可以消耗培養(yǎng)基中大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。劉洪清等^［7］采用添加EGF等細(xì)胞因子的方法，有效地促進(jìn)食管上皮細(xì)胞增殖和傳代，有效抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。EGF與靶細(xì)胞表面的EGF受體結(jié)合后，能刺激受體自身磷酸化及細(xì)胞內(nèi)其它蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活蛋白激酶C和磷脂酶C，通過(guò)第二信使CAMP、Ca²⁺激活CAMP依賴的蛋白酶，使細(xì)胞核內(nèi)組蛋白對(duì)DNA的阻遏作用解除，促使有絲分裂信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而引起DNA合成細(xì)胞增殖^［8］。但不同濃度的EGF對(duì)BMSC促分化和促增殖的影響作用不同，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

1.3 轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β 轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β（ transforming growth factor-β，TGF-β）是一類多功能的細(xì)胞因子，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)生成等。在干細(xì)胞向食管上皮分的過(guò)程中，TGF-β₁的突出作用是促使各種細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrixc，ECM），如膠原蛋白、連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、層黏蛋白（laminin，LN）和蛋白多糖的合成，抑制這些蛋白的降解，從而增加ECM的沉積^［9］。TGF-β通過(guò)與細(xì)胞跨膜蛋白受體結(jié)合發(fā)揮其生物作用，其跨膜蛋白受體有三種亞型TGF-β RAⅠ、RⅡ、RⅢ。RI、RII有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性，RⅢ可促進(jìn)TGF-β與RI、RII結(jié)合^［10］。TGF-β₁另一重要作用是刺激成纖維上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其機(jī)制說(shuō)法尚不統(tǒng)一。被TGF-β₁刺激增生的成纖維細(xì)胞能促進(jìn)食管上皮細(xì)胞增殖分化，有報(bào)道證實(shí)食管上皮細(xì)胞分層程度與加入成纖維細(xì)胞密度成正比^［11］。

1.4 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 （Insulin-like growth factor1，IGF-1）是一個(gè)重要的細(xì)胞增殖因子。在細(xì)胞周期中，一旦細(xì)胞進(jìn)入G₁期，在其他生長(zhǎng)因子缺乏的情況下，IGF-1可促進(jìn)C增殖周期的完成^［12］。IGF-1的活性主要是由胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）介導(dǎo)的，即IGF-1R很大程度上與細(xì)胞增殖狀況有關(guān)^［13］。它的這種作用，在組織工程食管上皮細(xì)胞分化增殖中十分重要。組織工程食管上皮在體外培養(yǎng)時(shí)，必然存在與體內(nèi)微環(huán)境的不同之處，缺乏某些細(xì)胞因子，IGF-1上述特點(diǎn)正好彌補(bǔ)了此種不足，值得關(guān)注的是IGF-1刺激細(xì)胞增生抑制凋亡，又是致食管癌的發(fā)生的重要因素。IGF-1活性主要由胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）來(lái)調(diào)控，故對(duì)IGFBPs的研究也值得進(jìn)一步深入研究。

1.5 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，BFGF），有研究表明，體積大于1 mm³的組織就需要血液供應(yīng)。組織工程中食管上皮細(xì)胞體積巨大，需要充足的血供，BFGF表達(dá)與食管中微血管密度有關(guān)。BFGF是一種堿性多肽，在體內(nèi)廣泛分布，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂素，它在體內(nèi)可趨化血管內(nèi)膜的各類細(xì)胞，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞表達(dá)組織重建所需的血漿酶原激活劑等，通過(guò)刺激內(nèi)膜各類細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入膠原基質(zhì)中形成管腔，并促進(jìn)神經(jīng)元與新生血管的生長(zhǎng)^［14］。BFGF在促進(jìn)神經(jīng)元生成的作用，為研究組織工程食管神經(jīng)的重建提供了新的思路與著手點(diǎn)。

2 細(xì)胞外基質(zhì)的影響

在組織工程食管中，高分了聚合材料結(jié)構(gòu)和成分單一，不能同時(shí)提供食管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的ECM。而種子細(xì)胞與ECM的黏附及相互作用是細(xì)胞分化增殖的基礎(chǔ)。故對(duì)ECM的研究，對(duì)組織工程食管上皮細(xì)胞分化增殖有重要意義。

2.1 膠原蛋白 研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原主要存在于食管的黏膜下層及肌層內(nèi)，Ⅲ型膠原主要存在于食管的外膜彈力纖維層和黏膜下^［15］。具有良好的生物相容性，極低的免疫原性，極強(qiáng)的促組織再生性^［16］。鮑春榮等^［10］用Ⅳ型膠原預(yù)涂材料表面，可有效地促進(jìn)食管上皮細(xì)胞與支架的吸附和均勻分布。但在食管中各型膠原蛋白的比例關(guān)系及各型膠原如何特異性作用于食管的特定部位，還有待研究。

2.2 纖維連接蛋白 纖維連接蛋白（FN）是一組結(jié)構(gòu)上類似、免疫源性相同的高分子糖蛋白，是體內(nèi)重要的細(xì)胞外基質(zhì)成份。它具有維持細(xì)胞正常形態(tài)參與細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)間的粘連，促細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能，在正常食管上皮有表達(dá)^［17］。在組織上工程食管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中，利用其具有細(xì)胞間或細(xì)胞與其他細(xì)胞外基質(zhì)間的橋蛋白作用，促進(jìn)食管上皮細(xì)胞的粘附，構(gòu)成其它增殖，分化的基礎(chǔ)。梁志剛等成功應(yīng)用轉(zhuǎn)染Ad.FnCBD64的食管上皮細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程食管。證明了FN具有增強(qiáng)種子細(xì)胞黏附力的效果。但FN分子量大，在實(shí)際的使用中存在轉(zhuǎn)染種子細(xì)胞的困難，有待于尋找促進(jìn)FN表達(dá)的實(shí)用性方法。

2.3 縫隙連接蛋白（Cx43） 縫隙連接蛋白（Connexins，Cx）的縫隙連接普遍存在于上皮細(xì)胞間，縫隙連接蛋白CX43表達(dá)與胚胎發(fā)育，細(xì)胞誘導(dǎo)，分化，生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)^［18］。劉學(xué)紅等^［19］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，2～4個(gè)月CX43蛋白呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，4個(gè)月后呈弱陽(yáng)性表達(dá)，推測(cè)在食管神經(jīng)系統(tǒng)及微循環(huán)系統(tǒng)未完善時(shí)期，Cx43通過(guò)參與細(xì)胞間縫隙連接調(diào)控信息轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的分化、增殖。在組織工程食管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)中，誘導(dǎo)種子細(xì)胞向食管上皮細(xì)胞分化，利用Cx43特性促進(jìn)分化增殖國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。筆者認(rèn)為有待從實(shí)驗(yàn)中得到求證。

3 性激素

從食管癌發(fā)生的性別差異，不難發(fā)現(xiàn)性激素可能參與了上皮細(xì)胞的增殖分化，但不論雌雄激素，發(fā)揮生理作用均與其受體密切相關(guān)，雌激素（ER）在胎兒食管→正常食管上皮兩者間出現(xiàn)到消失的規(guī)律。有學(xué)者認(rèn)為最好的解釋是ER參與了食管上皮細(xì)胞的增殖分化。ER的作用機(jī)制為雌激素彌漫入細(xì)胞后，先與靶細(xì)胞漿中特異性受體結(jié)合，形成激素受體復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，加上共激活因子的作用與核內(nèi)受體形成單二聚體，影響DNA轉(zhuǎn)錄生成新的mRNA，從而生成新的蛋白質(zhì)，影響細(xì)胞生理功能，雄激素（AR）作用機(jī)制與ER相似。但在性激素影響下產(chǎn)生了何種蛋白質(zhì)影響了生物學(xué)功能尚不清楚，且人體內(nèi)雌雄激素間存在復(fù)雜的相互影響，不同性別個(gè)體間雌、雄激素迥然不同，所以性激素對(duì)組織工程食管上細(xì)胞的分化影響還有待進(jìn)一步研究。

4 Ca²⁺濃度及O₂濃度的影響

4.1 Ca²⁺濃度與食管上皮細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān) Ca²⁺濃度低于0.05 mmol/L時(shí)食管上皮細(xì)胞缺少橋粒，當(dāng)Ca²⁺濃度大于等于0.05 mmol/L時(shí)角蛋白絲增加，橋粒出現(xiàn)。其機(jī)制可能為Ca²⁺充當(dāng)?shù)诙攀辜せ頒AMP依賴的蛋白激酶使細(xì)胞核內(nèi)組蛋白對(duì)DNA的組合解除，促使有絲分裂信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞引起DNA合成，細(xì)胞增殖，并且整合素等粘附分子發(fā)揮作用也需要Ca²⁺的存在。

4.2 O₂濃度的影響 O₂濃度為微環(huán)境對(duì)組織工程食管上皮細(xì)胞分化的影響報(bào)道不一，有學(xué)者用CoCl₂誘導(dǎo)缺氧條件，發(fā)現(xiàn)隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，處于G₀/G₁期的細(xì)胞明顯增加，S期減少，由此認(rèn)為，缺氧對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控^［20］。另一部分學(xué)者認(rèn)為供氧不足，缺氧信號(hào)迅速傳至細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，以維持細(xì)胞和機(jī)體氧平衡，在這一過(guò)程中引起細(xì)胞的增殖分化，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是影響調(diào)控的最主要因子。組織工程食管種子細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中，O₂濃度必然高于正常處于體內(nèi)的細(xì)胞，高O₂濃度的影響是有利于細(xì)胞增殖分化，還是不利于細(xì)胞增殖分化，有待于進(jìn)一步研究。

今后，組織工程食管的研究，應(yīng)深入研究微環(huán)境如何影響種子細(xì)胞向食管上皮細(xì)胞增生、分化，如何在體外模擬體內(nèi)的微環(huán)境。在不久的未來(lái)，組織工程食管必將應(yīng)用于臨床，給更多的患者減少病痛。

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（收稿日期：2011-07-04）

（本文編輯：車艷）