膠體金檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體性能評(píng)價(jià)

[摘要] 目的 對(duì)膠體金免疫層析（GICA）技術(shù)檢測(cè)患者血清抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體進(jìn)行性能驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和GICA，同時(shí)對(duì)104例可疑類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者進(jìn)行抗-CCP抗體檢測(cè)，計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的陰性符合率、陽性符合率、總符合率以及Kappa值。用±20%臨界值濃度標(biāo)本各重復(fù)檢測(cè)20次，記錄陰性和陽性結(jié)果數(shù)，驗(yàn)證GICA法重復(fù)性。結(jié)果 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較，陰性符合率、陽性符合率、總符合率、Kappa值分別為92%、100%、96%、0.92。GICA法檢測(cè)+20%臨界值濃度標(biāo)本結(jié)果陽性數(shù)為20次 ，陽性率100%；-20%臨界值濃度標(biāo)本結(jié)果陰性數(shù)為15次，陰性率為75%。結(jié)論 GICA法與ELISA法檢測(cè)抗-CCP抗體結(jié)果一致性良好，而且GICA方法簡(jiǎn)單、快速，敏感性和特異性較高，是早期篩查類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎值得推廣的方法。

[關(guān)鍵詞] 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體 ；膠體金免疫層析法 ；性能評(píng)價(jià)

[中圖分類號(hào)] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)]1673-9701（2011） 32-84-02

Performance Evaluation of Colloidal Gold Test for the Detection of Anti-cyclic Citrullinated Peptide Antibody

MU Yinyu WU Qiaoping WU Ludan

Department of Clinical Laboratory，Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital in Zhejiang Province，Ningbo 315040，China

[Abstract] Objective To verify and evaluate the performance of the anti-cyclic citrullinated peptide antibody（CCP） by the rapid colloidal gold immunochromatographic strip．Methods All 104 serum samples were detected parallelly by ELISA and GICA，calculating the negative rate，the positive rate，the total rate and Kappa value．The samples of ±20% concentration of cutoff were detected 20 times repeatedly，recording the positive and negative number．Results The negative rate，the positive rate，the total rate and Kappa value of the two test were 92%，100%，96% and 0.92．The positive rate of +20% concentration of cutoff was 100% ，and the negative rate of -20% concentration of cutoff was 75%. Conclusion The consistency of the ELISA and GICA for the anti-cyclic citrullinated peptide antibody is good．GICA kit is simple and easy to operate，relatively high sensitivity and specificity．It is a useful assay in the clinical early screening inspecting of RA．

[Key words] Anti-cyclic citrullinated peptide antibody；Colloidal gold immunochromatography；Performance evaluation

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性關(guān)節(jié)病，病因和病理機(jī)制還不是很明確。其特征性癥狀為對(duì)稱、多個(gè)周圍性關(guān)節(jié)的慢性炎癥病變，臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作的過程，很多患者兩年內(nèi)出現(xiàn)不可逆骨破壞。RA可發(fā)生于任何年齡和性別，但多數(shù)在40～60 歲發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類特別是老年人的健康；我國(guó)的發(fā)病率為0.32%～0. 36%[1]。目前對(duì)于RA 的診斷采用2009年第73屆美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)年會(huì)（ACR/ARPH）公布的最新的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，新標(biāo)準(zhǔn)將抗-CCP抗體檢測(cè)納入其中。在臨床應(yīng)用中，抗-CCP抗體逐步發(fā)展成為早期診斷RA的首選檢測(cè)指標(biāo)。近10年世界各國(guó)檢測(cè)抗-CCP抗體多采用ELISA法，由于該方法繁瑣，操作復(fù)雜，并未在國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)普遍使用。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展，2010年5月上海富莼科芯公司首家研制出抗-CCP抗體膠體金免疫層析法試劑盒，使RA的早期篩查的普及成為可能。本文通過與ELISA方法對(duì)比，對(duì)該公司的該試劑盒檢測(cè)抗-CCP抗體的性能進(jìn)行了驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

根據(jù)2009年第73屆美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)年會(huì)（ACR/ARPH）公布的最新的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集2010年10~12月間寧波李惠利醫(yī)院門診和住院可疑RA患者104例，其中男23例，女81例，年齡22～82歲，平均年齡52歲；其中抗-CCP抗體陽性和陰性標(biāo)本各52例。

1.2 試劑與儀器

ELISA法試劑盒由德國(guó)歐蒙公司生產(chǎn)，GICA試劑盒由上海富莼科芯生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。美國(guó)伯樂（BIO-RAD）680酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)抗-CCP原理 以硝酸纖維膜作為固相載體，分別在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)劃線包被CCP抗原和質(zhì)控物。測(cè)試時(shí)，樣本滴入加樣孔后，血清中的IgG與包被在聚酯膜上的膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合，結(jié)合物隨之在毛細(xì)效應(yīng)下橫向?qū)游?。?dāng)血清中含有特異性抗-CCP抗體時(shí)，泳動(dòng)到檢測(cè)區(qū)時(shí)被CCP抗原捕獲，出現(xiàn)陽性條帶，游離標(biāo)記物繼續(xù)向前移動(dòng)與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離，泳動(dòng)至質(zhì)控區(qū)被捕獲形成陽性質(zhì)控線。若樣本中不含抗-CCP抗體，則檢測(cè)線處不發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，膠體金標(biāo)記物繼續(xù)層析向前與包被于質(zhì)控線處質(zhì)控抗體結(jié)合而形成陽性條帶，多余的膠體金標(biāo)記物繼續(xù)層析到吸水墊上。

1.3.2 方法學(xué)比較 （1） 將104份標(biāo)本隨機(jī)分成13組，每組8份，保存于-20℃，每天取出一組，測(cè)定前充分復(fù)融。室溫下嚴(yán)格按照說明書操作。（2）根據(jù)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方案[2]，每天用兩種方法平行測(cè)定一組，連續(xù)13d。將所有檢測(cè)結(jié)果匯總，以ELISA方法為參考方法，進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)一致性。同時(shí)計(jì)算兩種方法陽性和陰性符合率以及總符合率。

1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 高值：在臨界值（25RU/L）基礎(chǔ)上準(zhǔn)備+20％濃度（30RU/L）的樣本。低值：在臨界值基礎(chǔ)上準(zhǔn)備-20％濃度（20RU/L）的樣本。經(jīng)ELISA方法檢測(cè)后，收集混合而成。將高值和低值各分裝20份，保存于-20℃。室溫下嚴(yán)格按照說明書操作。每天取出高值和低值各1份，連續(xù)檢測(cè)20d，記錄陰性及陽性結(jié)果數(shù)。

1.4 性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 兩種方法一致性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn) Kappa值＞0.75表示具有優(yōu)秀的一致性；Kappa值0.4～0.75，認(rèn)為相當(dāng)好的一致性；Kappa值＜0.4，一致性很差。

1.4.2 陽性、 陰性符合率驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn) 若檢測(cè)結(jié)果和參考方法結(jié)果相比較一致，則視為驗(yàn)證的方法陽性、陰性符合率性能符合要求。

1.4.3 臨界值±20%重復(fù)性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明+20%濃度的樣本產(chǎn)生陽性結(jié)果數(shù)≥95%，同時(shí)-20%濃度的樣本產(chǎn)生陰性結(jié)果數(shù)≥95%，說明用該方法檢測(cè)臨界值+20%的樣本檢測(cè)結(jié)果一致。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)兩種方法檢測(cè)抗-CCP抗體陰性符合率、陽性符合率、總符合率；兩種方法一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法一致性

兩種方法檢測(cè)104 例血清抗-CCP抗體結(jié)果：ELISA法檢出52例陽性，52例陰性；金標(biāo)法檢出陽性56例，陰性48例。可算出兩種方法檢測(cè)抗-CCP抗體，陰性符合率為92%，陽性符合率為100%，總符合率為96%。Kappa值等于0.92。見表1。

2.2 GICA法重復(fù)性

由表2可見，用GICA法重復(fù)檢測(cè)20次高值，20次陽性，陽性率100%；重復(fù)20次檢測(cè)低值，陽性5次，陰性15次，陰性率75%。

3 討論

目前臨床上檢測(cè)抗-CCP抗體多采用ELISA法，特異性和敏感度都比較高，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作過程繁瑣，不適合常規(guī)操作。而GICA法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)[3]，可單份測(cè)定，特別適合標(biāo)本量少、人手緊張、設(shè)備有限的中小醫(yī)院廣泛開展與使用，便于臨床推廣。

本研究以ELISA法作為參考方法，與GICA法進(jìn)行比較，研究結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)總符合率為96%，Kappa值為0.92，兩方法一致性良好。此外，GICA檢測(cè)52例陰性標(biāo)本，有4例弱陽性，說明GICA敏感性比較高，可能有假陽性產(chǎn)生，尤其是弱陽性的標(biāo)本。所以臨床應(yīng)用過程中，要結(jié)合臨床癥狀，排除假陽性現(xiàn)象。

GICA重復(fù)性試驗(yàn)顯示，+20%臨界值濃度標(biāo)本，重復(fù)性為100%，說明用該方法檢測(cè)，+20%臨界值濃度標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果一致。而-20%臨界值濃度標(biāo)本，重復(fù)性只有75%，不是很理想，說明-20%臨界值濃度的樣本，用該方法檢測(cè)，卻不一定能得到一致結(jié)果。這也是定性試驗(yàn)的缺陷，臨界值附近的濃度標(biāo)本，可出現(xiàn)陰性或陽性的結(jié)果。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎2009年新診斷標(biāo)準(zhǔn)，將抗-CCP抗體納入其中，為RA早期診斷提供了金標(biāo)準(zhǔn)，臨床上運(yùn)用也越來越廣泛。大量研究己證實(shí)了抗-CCP抗體對(duì)RA具有高特異性，有助于與其他風(fēng)濕性疾病相區(qū)別[4~6]。抗-CCP抗體不但能及早提示RA的發(fā)病，且對(duì)已明確診斷的RA患者，和其他自身免疫性疾病患者，檢測(cè)抗-CCP抗體也是有臨床意義的[7]，它的陽性可能提示患者易發(fā)生或已發(fā)生骨侵蝕破壞，治療時(shí)，應(yīng)注重聯(lián)合治療，且預(yù)后往往較差。因此常規(guī)體檢，尤其是中老年人的體檢可以在原有血清學(xué)檢測(cè)中加入抗CCP抗體檢測(cè)，以達(dá)到早篩查、早診斷、早預(yù)防、早治療、改善預(yù)后。

總而言之，膠體金免疫層析法檢測(cè)抗-CCP抗體，性能可靠，操作簡(jiǎn)便、快速，完全能夠滿足對(duì)RA的初步篩查，值得在臨床推廣使用。

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（收稿日期：2011-08-23）