混合酶消化法大鼠顱蓋骨細胞的原代培養和鑒定

基金項目：福建省自然科學基金項目（編號：2908）

作者單位：350004 福建醫科大學省立臨床學院（孫玲）；福建省立醫院（侯建明）

通訊作者：侯建明

【摘要】 目的 通過不斷的摸索，尋找一種獲得細胞數量較多且純的原代成骨細胞的體外培養方法，為下一步實驗研究奠定基礎。方法 取出生24 h內的SD大鼠脫臼處死，取出顱蓋骨，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織片；采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合酶消化法分離獲得原代成骨細胞；采用“差速貼壁法”進行純化。通過對細胞形態學的鏡下觀察，堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化法等對細胞進行鑒定。結果 鏡下觀察所獲得的細胞具有成骨細胞的典型特征，細胞多為單核，呈三角形、多邊形、長梭形等形態，并伸有粗大偽足；堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性。結論 采用混合酶消化法可獲得數量較多且活性較好的細胞，再采用“差速貼壁法”可以去除成纖維細胞等雜質細胞，獲得純度較高的成骨細胞。

【關鍵詞】 成骨細胞； 原代培養； 大鼠； 混合酶消化法

Primary culture and identification of rats cranial cover osteocytes SUN Ling，HOU Jian-ming.Fujian Medical Uniersity， Fuzhou 350004， China

【Abstract】 Objective Through continuous exploration， we want to search for a method of cultivating the original generation osteoblasts in vitro which can gets a larger quantity and pure the original generation of osteoblasts， to prepare for the next experiment research.Methods 24 hours old of SD rats were executed by dislocating.The cranial cover bones of rats were removing and cuting into the blocks of 1mm x 1mm x 1mm size. The crinial bones were digesting by mixed enzyme which contains enzyme andⅠtype collagenase.The osteoblast were purified by selective plating technique. The osteoblasts were identified through morphlogy observation， alkaline phosphatase dyeing， collagenⅠimmunohistochemical staining.Results The cultured cells have the typical features of osteoblast.The cells are triangle， polygonal， long spindle shape， etc.and mostly are mononuclear cells， have large pseudopodia. Alkaline phosphatase dyeing collagenⅠimmunohistochemical staining are both positive.Conclusion A large quantity and activity of the good cells were obtained by mixed enzyme digestion method. High purity osteoblasts were obtained by selective plating technique that can remove impurities such as fibroblast cells.

【Key words】 Osteoblast； Primary culture； Rat； Mixed enzyme digestion

隨著中國人口老齡化的到來，骨質疏松的發病率呈上升趨勢，骨質疏松的發病機制和治療的研究也越來越引起人們的重視。為了探討各種基因在成骨細胞中的表達以及外源性基因對成骨細胞的影響，建立一種簡單，高效的成骨細胞培養方法成為目前各種科學研究的必要條件。目前原代培養的成骨樣細胞方法很多，各種方法獲得的細胞數量、活性多不一致。筆者的研究在于通過不斷的摸索，獲得一種既操作簡單，又能獲得細胞量較多且成活率較高的原代細胞培養方法，為下一步的實驗奠定堅實的基礎

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及實驗動物 出生24 h內的SD大鼠6只（吳氏實驗動物），DMEM培養基（Hyclone）、胎牛血清（Hyclone）、0.25%胰酶（加EDTA）（Hyclone）、Ⅰ型膠原酶（Sigma）、L-谷氨酰胺（Amersco）、青霉素（中諾藥業）、鏈霉素（山東魯抗藥業）、堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物公司）、Ⅰ型膠原SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）、水套式二氧化碳培養箱（上海力新設備有限公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、生物安全柜（北京 BSC-1100IIB2公司）、HJ-3型恒溫磁力攪拌器（江蘇天由有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 顱蓋骨細胞的分離與純化 取出生24 h內的SD大鼠6只，脫臼處死，采用75%酒精消毒后，剪下頭部，置于75%的酒精中消毒5 min。取出，置于裝有PBS的培養皿中，用眼科鑷撕開頭部皮膚，眼科剪剪下顱蓋骨，剔除掉結締組織，用PBS沖洗幾遍直至顱蓋骨發白，再剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織片；將組織片移至一裝有轉子的離心管中，PBS洗3遍，加入3 ml的0.25%的胰酶，在37 ℃恒溫磁力攪拌器上消化15 min，棄去消化液；再加入4 ml的0.1% Ⅰ型膠原酶及1 ml的0.25%的胰酶，在37 ℃的恒溫磁力攪拌器上消化60 min后，用移液管將消化液移至一新的離心管中，加等量培養基中和后，1000 r/min離心10 min，棄去上清，加入3 ml培養基吹打混勻制成細胞懸液，種植到50 cm²的培養瓶中。再加入4 ml的0.1% Ⅰ型膠原酶和1 ml的0.25%的胰酶在磁力攪拌器上消化30 min后，按上述方法種植到另一50 cm²的培養瓶中；置于37 ℃，5%CO培養箱中培養。由于成骨細胞中較易混雜成纖維細胞生長，利用成骨細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，首次種植就采用多次“差速貼壁法”達到純化成骨細胞的目的，以防成纖維細胞生長過快抑制成骨細胞生長。

1.2.2 細胞的培養與傳代 細胞每2～3 d換一次液，原代細胞首次傳代，待細胞長滿瓶底時約需6～7 d，棄去原培養液，用PBS洗一次，再加入2～3 ml的0.25%胰酶消化約2～3 min，按1∶2的比例進行傳代，以后每4 d傳代一次。在傳代的過程中，因成纖維細胞等易被胰酶消化脫落，成骨細胞不易被消化脫落，用胰酶消化至少許細胞脫落，其余細胞變圓時，即使棄去脫落細胞，細胞傳代接種后再次采用“差速貼壁法”進一步純化細胞。

1.2.3 原代成骨細胞的鑒定 （1）細胞形態學觀察：在倒置顯微鏡下觀察細胞形態結構。（2）ALP（堿性磷酸酶）染色：采用偶氮偶聯法。取制備好的密度適中的細胞爬片，用固定液固定約3 min左右，再加入底物應用液避光37 ℃孵育15 min，水洗，采用蘇木素進行復染，水洗，鏡檢。（3）Ⅰ型膠原免疫組化（SABC法）：多聚甲醛固定30 min后，水洗，去離子水孵育10 min；滴加山羊血清工作液，室溫孵育15 min，甩去多余液體，勿洗；滴加兔抗大鼠的Ⅰ型膠原抗體，37 ℃孵育2～3 h，水洗；加入“二抗”，室溫孵育20 min；滴加SABC試劑，室溫孵育20 min，水洗；采用DAB試劑盒顯色；蘇木素輕度復染。

1.2.4 細胞生長曲線的繪制 取第二代成骨細胞，以3萬/孔定量接種于24孔板中，每日取出24孔板中的3孔進行計數，計數8 d，繪制出混合酶消化法所獲得的原代成骨細胞生長曲線。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 原代培養的大鼠顱蓋骨細胞有典型的成骨細胞特征，細胞貼壁生長，呈鱗片狀，體積較大，胞漿豐富，多為單核，呈“鋪路石樣”排列，胞漿向外伸展，并伸出突觸。見圖1、圖2。

2.2 堿性磷酸酶染色結果 細胞采用偶氮偶聯法染色顯示，細胞核呈藍紫色，胞漿中有咖啡色顆粒，有少量顆粒分散在細胞周圍，顯示為陽性反應，說明所培養細胞具有分泌ALP的功能，符合成骨細胞特征。見圖3。

2.3 Ⅰ型膠原免疫組化結果 免疫組化染色結果陽性，胞漿被染成棕黃色，符合成骨細胞特征。見圖4。

2.4 細胞生長曲線結果 細胞傳代后第4～5 d達到對數生長期。見圖5。

3 討論

3.1 成骨細胞的來源、分離與培養 成骨細胞的來源可分為細胞株和原代培養。目前已經建系的骨細胞株種類較少，而且細胞株在不斷的傳代過程中，骨細胞的某些生物學特性會發生變化，從而影響實驗結果的準確性。另外，有些細胞株對生長條件的要求比較高，在購買運輸的過程中細胞的活性會受到影響，導致購買的成骨細胞不易成活。而原代培養，由于其生物學性狀尚未發生很大改變，故成骨細胞的原代培養，仍是目前進行成骨細胞體外實驗的主要方法^［1］。原代成骨細胞的組織來源上多采用兔，乳鼠等的顱蓋骨或者大腿骨進行成骨細胞的分離、培養，也有采用動物下頜骨或人髂骨作為組織來源的。有研究表明^［2］，成熟大鼠顱蓋骨細胞狀態穩定，是用于骨質疏松相關的骨形成和藥物篩選的最適宜細胞系。

原代成骨細胞的分離方法主要有兩種，酶消化法和組織塊法。目前應用較多的是酶消化法，常用于消化分離細胞的有胰酶和膠原酶。胰蛋白酶雖然被廣泛應用于細胞原代培養，但其活性強，蛋白水解效率高，特別是對組織構成較特別的骨組織來說，消化時間難以掌握，容易損傷細胞及胞膜上的功能蛋白，影響細胞的活性和功能^［3］。膠原酶對細胞作用強度較緩和，對細胞間質有較好的消化作用，對細胞本身影響不大。

成骨細胞分泌基質中的主要成分是Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原酶是Ⅰ、Ⅲ膠原水解的關鍵酶^［4］，但在實驗的過程中筆者發現，單獨采用Ⅰ型膠原酶，細胞不易消化分離，獲得的細胞量較少。但是后來采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合消化法，并采用37 ℃恒溫磁力攪拌器加速消化，則可以獲得較多且活力較好的成骨細胞。先用胰酶消化15 min的目的是清除纖維組織，松解成骨細胞，既減輕了膠原酶消化過程中對細胞的損傷，又去除了酶消化過程中的部分雜質細胞，起到一定的純化作用^［5］。另外在傳代過程中多次采用差速貼壁法進一步純化了細胞。

通過多次的摸索，本實驗發現要想獲得數量較多且活性較好的原代成骨細胞，以下幾點需要注意：（1）盡量選取剛出生24 h內的乳鼠作為實驗動物來源。因新生乳鼠顱蓋骨為板層骨，幾乎沒有髓腔和小血管，因此混雜的內皮細胞數量較少。若選日齡較大的乳鼠，則在消化的過程中消化的細胞量較少，即使通過延長消化時間的方法獲得了一定量的細胞，則細胞中混雜的雜質細胞較多，且細胞活力不好。（2）培養的過程中盡量采用低糖培養基，采用高糖培養基在初始階段對細胞的生長有促進作用，但是長期使用高糖培養基反而會對細胞造成毒性。筆者在培養的過程中發現，使用高糖培養基1周以后，貼壁的細胞開始出現大量凋亡、脫落現象，直至細胞全部死亡；但是使用低糖培養基一周后，細胞生長仍然良好，沒有出現凋亡、脫落現象。（3）在細胞的傳代過程用在成骨細胞傳代的過程中，棄去培養液加入胰酶前，一定要用PBS沖洗一遍，否則細胞不易消化下來，傳代時間不要太晚，否則細胞提前分化、衰老、活力下降而不易成活。在細胞的傳代過程中，細胞密度適當增高，細胞生長狀態會更好。（4）在采用混合酶消化法分離細胞的過程中，0.1%的Ⅰ型膠原酶和0.25%胰酶的比例按4：1時消化效果較好，獲得的細胞數量較多，且活力較好。如果胰酶的比例增高，所獲得的細胞活力反而下降。

3.2 成骨細胞的鑒定 對成骨細胞的鑒定，目前尚未有統一的金標準。被廣泛采用的是形態學觀察和其分泌的細胞外基質鑒定，如ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素及鈣化結節等^［6］。成骨細胞可以通過基質小泡釋放鈣離子和ALP等物質，ALP水解磷酸酯以釋放無機磷，增加其局部濃度，促進機制礦化，因此，ALP是成骨細胞分化的代表性酶，在體外鈣化中起關鍵行作用，是成骨細胞表型特征之一^［7］。而Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌基質中的主要定型成份，占細胞外分泌基質的90%，是成骨細胞增殖和分化過程中增加最多的生物大分子^［8］。

本實驗所培養的原代細胞在鏡下觀察，細胞貼壁生長，呈鱗片狀，有三角形、多邊形、梭形等多種形態，呈“鋪路石樣”排列，細胞胞漿豐富，多呈單核，并伸有粗大偽足，與多數文獻所述成骨細胞形態一致。本實驗ALP染色采用偶氮偶聯法，細胞染色陽性，說明所培養細胞具有分泌堿性磷酸酶的功能，符合成骨細胞功能特性；Ⅰ型膠原免疫組化染色，細胞呈陽性，對照組陰性，說明所養細胞具有分泌Ⅰ型膠原的功能，符合成骨細胞特性。

綜上所述，本實驗采用胰酶和Ⅰ型膠原混合酶法所獲得細胞符合成骨細胞的典型特征，具備成骨細胞的生物學功能，并且采用多次差速貼壁法，達到了純化成骨細胞的目的，細胞成分較單一，可以應用于下一步的實驗研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-03-21）

（本文編輯：車艷）