正常妊娠外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞和雌二醇水平變化的研究

作者單位：437500 湖北省崇陽縣人民醫院

通訊作者：姜玲

【摘要】 目的 探討外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率和雌二醇水平在正常妊娠整個過程中的變化。方法 采用三色熒光標記流式細胞術檢測正常非妊娠健康女性（對照組），早早孕組、早孕組、中孕組、晚孕組各35例婦女外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率；采用電化學發光酶免分析技術分別檢測以上各對象外周血雌二醇水平。結果 對照組和早早孕組外周血雌二醇水平明顯低于早孕組、中孕組、晚孕組（P＜0.05），并且隨孕周增大而升高（P＜0.05）；對照組和早早孕組外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率明顯低于早孕組、中孕組、晚孕組（P＜0.05），并且隨孕周增大而升高（P＜0.05），晚孕組略低于中孕組，但無統計學意義（P＞0.05）。結論 正常妊娠過程孕8周左右之后CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率和雌二醇水平均呈現明顯升高，并且隨孕周增大而升高，正常的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率和外周血雌二醇水平在維持正常妊娠過程中發揮重要作用。

【關鍵詞】 妊娠； CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞； 雌二醇

CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞是具有免疫調節功能的細胞群，通過直接免疫抑制或分泌抑制性細胞因子發揮間接免疫抑制功能，是維持機體外周免疫耐受的一個重要調控者。越來越多的研究認為，妊娠期孕婦體內CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg 調節性T細胞（Treg細胞）介導對胚胎產生保護性免疫應答是維持正常妊娠的重要保障，并在誘導和維持母胎免疫耐受中起重要作用^［1，2］，而雌二醇則可能是讓在耐受環境下激活的CD4⁺細胞轉向FOXP3⁺Treg的信號^［3］。因此，本研究就正常非妊娠女性及妊娠婦女各階段外周血雌二醇水平和Treg細胞數量比例增殖和恢復展開討論，探討外周血Treg細胞數量和雌二醇水平變化與維持正常妊娠的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 妊娠組分為早早孕組、正常早孕組、正常中孕組和正常晚孕組，各35例，孕周依次為7周以內、8～12周、13～23周和24周以上，孕婦年齡25～34歲，平均28歲，全部孕婦均選取來自筆者所在醫院定期產檢的孕婦，既往無死胎、自然流產、放射性職業、自身免疫性疾病史。同時排除內分泌、解剖結構、染色體異常病例。對照組即正常非妊娠組35例，年齡26～33歲，平均29歲，均隨機選取來筆者所在醫院正常體檢女性，均有妊娠史，既往無死胎、自然流產、放射性職業、自身免疫性疾病史，同時排除內分泌、解剖結構、染色體異常病例。

1.2 主要儀器和試劑 采用德國ROCH公司2010型電化學發光儀和美國COULTER公司生產的EPICSXL型流式細胞儀，雌二醇試劑采用ROCH公司電化學發光配套試劑，eBioscience公司提供的小鼠抗人CD4、CD25和FOXP3熒光抗體和同型對照檢測試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 外周血雌二醇水平檢測 取上述各研究對象靜脈血2 ml置于無菌干燥管內，靜置30 min后離心4000r/min，離心5 min分離出血清，嚴格按照ROCH公司2010型電化學發光儀操作規程檢測雌二醇水平。

1.3.2 外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率檢測 采用標準全血裂解法，取上述各研究對象靜脈血2 ml置于肝素抗凝管，充分混勻后各取100 μl細胞懸液，分別加入CD4-FITC和CD25-PE各15 μl，混勻后避光孵育30 min，離心去上清，加入固定破膜劑，混勻后避光放置20 min，離心去上清，取100 μl Hank's液重懸、15 μl PE-Cy5-FOXP3單克隆體抗，混勻后避光放置30 min，嚴格按照COULTER EPICSXL型流式細胞儀操作規程檢測CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞比例。同時分別用PE-IgG1、FITC-IgG1、PE-Cy5-IgG1抗體作同型對照實驗。

1.4 統計學分析 采用SPSS 15.0軟件包進行實驗數據的統計分析。各妊娠組與對照組比較和早、中、晚孕組與早早孕組的比較均采用成組設計t檢驗，各妊娠組間比較采用方差分析和SNK-q檢驗，各組數據以均數±標準差（x±s）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

從結果比較發現，外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率，對照組（8.54%±2.90%）和早早孕組（9.32%±1.96%）明顯低于早孕組（13.38%±3.35%）、中孕組（19.33%±4.49%）、晚孕組（18.51%±3.98%），差異有統計學意義（P＜0.05），并且隨孕周增大而升高（P＜0.05）（圖1）；外周血雌二醇水平，對照組（135.25±171.31） pmol/L和早早孕組（453.62±352.31 ）pmol/L明顯低于早孕組（17107.28±16623.81）pmol/L、中孕組（80019.95±49210.01）pmol/L、晚孕組（121010.37±65799.32 ）pmol/L，差異有統計學意義（P＜0.05），并且孕周越大雌二醇水平越高（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

近來研究表明，妊娠具有半同種移植的性狀，介導母胎免疫耐受，對胎兒產生保護性免疫應答，對于維持整個妊娠，避免孕婦與胎兒半同種異體抗原產生排斥反應有重要的意義。在整個妊娠過程中，隨著胎兒的發育，暴露于母體的抗原逐漸增多，而不被母體排斥產生免疫耐受是母體免疫系統包括某些激素水平（如E₂、HCG、PRL等）有效調節的結果。目前研究認為，排除由胸腺輸出增高而在外周發生擴增的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞，是在維持機體外周免疫耐受的一個重要調控者，正常的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞數量和功能可使母體對胎兒半同種異體抗原發揮免疫抑制保護作用，可能是通過細胞產生特異性封閉抗體和抑制性免疫細胞主動抑制自身免疫性T細胞活化的機制誘導母胎免疫耐受，使胚胎免遭攻擊的原因，促使妊娠成功。

CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞具有的免疫調節作用，在維持內環境穩定、誘導移植免疫耐受也發揮著重要的作用^［4，5］。Somerset等^［6］研究發現，妊娠婦女在早期CD4⁺CD25⁺顯著升高，中孕達到最高峰，FOXP3⁺Treg細胞是調控CD4⁺CD25⁺的重要因子。本研究發現，正常妊娠婦女外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率在孕8周左右開始明顯升高，這與肇靜嫻等^［7］報道相符，可能與胎盤絨毛植入和大量胎兒自身抗原產生有關。同時中孕組CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率明顯高于早孕組，晚孕組略有下降趨勢，CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率略低于中孕組，但無統計學意義。Sindram-Trujillo等^［8］報道表示，CD4⁺CD25⁺下降與誘導分娩有相關性。本研究結果提示，正常婦女外周血中存在一定數量免疫抑制功能的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞，并且在妊娠過程中可誘導和維持母體對具有半同種異體抗原胎兒的免疫耐受，從而保護正常的妊娠過程。

雌二醇是雌激素中生命活性最強的一種，主要作用于垂體，也是妊娠期重要的性激素之一。妊娠6周前E₂主要來源于卵巢分泌，6周后則主要來源于胎盤。有研究發現，而E₂則可能是讓在耐受環境下激活的CD4⁺CD25⁺細胞轉向FOXP3⁺Treg的重要信號，并通過促進CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞的增殖來增強其免疫抑制功能。本研究結果認為，正常妊娠婦女外周血E₂水平明顯高于正常非妊娠婦女，并且隨孕周增加而升高；同時又發現妊娠婦女外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞數量與其E₂水平有相似的變化規律。結果提示，外周血E₂規律性變化是有效妊娠的重要因素之一，可能通過促進CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞的增殖在誘導妊娠免疫耐受中發揮重要作用，從而保證正常的妊娠過程。

綜上所述，外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細胞百分率與雌二醇水平的規律性變化對誘導母胎免疫耐受，維持正常妊娠有重要意義。

參 考 文 獻

［1］ Stephens LA， Mottet C， Mason D， et al.Human CD4（+）CD25（+） thymocytes and peripheralT cells have immune suppressive ac-tivity in vitro.Eur J Immuno，2001，31（4）:1247-1254.

［2］ Aluvihare VR， Kallikourdis M， Betz AG. Tolerance， suppression and the fetal allograft.JMolMed， 2005，83（2）: 88-96.

［3］ Polanczyk MJ， Carson BD， Subramanian S， et al. Cuttingedge: estrogen drives expansion of the CD4+CD25+regula-tory T cell compartment. J Immunol， 2004， 173（4）:2227-2230.

［4］ Paust S， Cantor H. Regulatory T cells and autoimmune disease. ImmunolRev， 2005， 204: 195-207.

［5］ 劉清泉，黃長形.CD4+CD25+調節性T細胞和感染免疫.醫學研究生學報， 2006， 19（8）: 741-744.

［6］ Somerset DA， Zheng Y， Kilby MD， et al Normalhuman pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25⁺CD4⁺regulatory T-cell subset. Immunology， 2004， 112（1）: 38-43.

［7］ 肇靜嫻， 曾耀英，劉毅.妊娠期調節性T細胞介導保護性效應需要同種抗原的刺激.現代免疫學，2006，26（3）：226-230.

［8］ Sindram-Trujillo AP， Scherjon SA， van Hulst-van Miert PP， et al.Comparison of decidual leukocytes following spontaneous vaginal delivery and elective cesarean section in uncomplicated human termpregnancy. J Reprod Immunol， 2004， 62（1-2）:125-137.

（收稿日期：2011-04-21）

（本文編輯：王春蕓）