靶向Twist基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細(xì)胞化療敏感性的研究

作者單位：266409 山東省膠南市泊里鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院（臧泉紅）；濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（陳昭日，張麗芹，戴淼，王春一，呂秀萍）

通訊作者：戴淼

【摘要】 目的 探討載體表達(dá)的小干擾RNA（siRNA）影響卵巢癌耐藥細(xì)胞株Twist基因的表達(dá)、促進(jìn)凋亡并逆轉(zhuǎn)其阿霉素耐藥的可行性。方法 體外構(gòu)建Twist小發(fā)卡狀RNA（shRNA）的表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體法介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染入SKOV3/ADM細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Twist mRNA的表達(dá)；使用免疫細(xì)胞化學(xué)法（ICC）檢測Twist蛋白的表達(dá)；使用四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）測定各組細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)抑制濃度（IC50）；流式細(xì)胞術(shù)檢測其對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 Twist shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Twist mRNA 的表達(dá)與其他兩組相比明顯減弱，Twist蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；阿霉素敏感性比正常對照組提高了約2.5倍；流式細(xì)胞儀顯示阿霉素作用24 h后，特異性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，G₀/G₁期細(xì)胞比例增多，而S期細(xì)胞比例減少，凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 針對TWIST合成的siRNA能夠有效地抑制TWIST mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡并能恢復(fù)其對阿霉素的敏感性。應(yīng)用RNAi技術(shù)，能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】 卵巢癌腫瘤； Twist； RNA干擾； 逆轉(zhuǎn)耐藥； 凋亡

化療為卵巢癌主要的輔助治療手段，以阿霉素為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療使卵巢癌患者的生存時間明顯延長，但其五年生存率卻無明顯提高，主要原因是隨著化療時間的延長，腫瘤細(xì)胞逐漸對各種化療藥物尤其是阿霉素產(chǎn)生了耐藥性。因此，阿霉素化療增敏劑的研究在臨床上有重要意義。Twist是轉(zhuǎn)錄因子家族中編碼鋅指蛋白的基因，與細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，并在多數(shù)惡性腫瘤中過度表達(dá)^［1，2］。另外，抑制Twist表達(dá)，能增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性^［3，4］。本研究旨在研究干擾Twist基因?qū)β殉舶┠退幖?xì)胞SKOV3/ADM的耐藥性影響，以進(jìn)一步闡明卵巢癌的耐藥機制，為臨床提供新的治療方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和菌株 人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/ADM購自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，其親本細(xì)胞株SKOV3由濰坊醫(yī)學(xué)院腫瘤內(nèi)科饋贈；大腸桿菌DH5a由濰坊醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室保存。

1.1.2 主要試劑及來源 空質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo購自Ambion公司；大提質(zhì)粒試劑盒購于Omega公司；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購自普利萊公司；Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP均購自上海生工公司；兔抗人Twist－抗、SABC（兔IgG）－POD試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；阿霉素為齊魯制藥凍干型制劑；MTT （四甲基偶氮唑鹽）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小干擾RNA的構(gòu)建 利用Ambion公司在線設(shè)計程序，設(shè)計為能表達(dá)其發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小RNA（shRNA）的DNA序列順義鏈和反義鏈。正義和反義寡核苷酸鏈由上海生工合成，各由2.0 OD加ddH₂0（去離子水）配制成3 mg/ml溶液。

1.2.2 重組質(zhì)粒pTWIST-shRNA鑒定和純化 已構(gòu)建好的兩條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈，與質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo連接為pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素的LB平板篩選，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I、HindⅢ雙酶切鑒定，并測序證實插入序列為所設(shè)計的發(fā)卡序列。按大提質(zhì)粒試劑盒的步驟提取并純化質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長的SKOV3/ADM細(xì)胞加入阿霉素使其終濃度為20 μg/ml，作用1 h。間歇作用誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，采用該方法連續(xù)誘導(dǎo)3次。耐藥的SKOV3/ADM細(xì)胞分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：空載體轉(zhuǎn)染組、非特異轉(zhuǎn)染組、pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，接種于6孔板，每孔2×10⁵個細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)90%融合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染Twist-siRNA后48 h收集細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)實驗。

1.2.4 RT-PCR檢測Twist mRNA表達(dá) 按Trizol試劑說明書的要求提取各組細(xì)胞總RNA。按Reverse Transcription System 的說明書采用特異性下游引物法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。聚合酶鏈（PCR）反應(yīng)，Twist上游引物：5'-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3'；下游引物：5'-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3'，擴增產(chǎn)物長262 bp。以β-actin為內(nèi)參照，94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 45 s，循環(huán)30次后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線透射觀察儀觀測、照相，用Band Scan圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，以Twist與β-actin相對比值，比較各組細(xì)胞Twist mRNA的表達(dá)差異。

1.2.5 免疫組化法檢測細(xì)胞Twist表達(dá) 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞爬片，然后按照說明書進(jìn)行固定、染色、脫色、封片，在顯微鏡下觀察并照相。

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)抑制濃度（IC50） 實驗分四組：空載體轉(zhuǎn)染組、非特異轉(zhuǎn)染組、pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組。取對數(shù)生長的SKOV3/ADM，制成1×10⁵ 個/ml細(xì)胞懸液，接種96孔板，每孔100 μl培養(yǎng)液，約含2×10³ 個細(xì)胞，37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在細(xì)胞90%融合時開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后設(shè)6個加藥孔，分別加入不同濃度的DDP（終濃度1.25 μg/ml至40 μg/ml），藥物濃度按兩倍比增加，每樣本設(shè)4個平行孔，對照組不加藥物，另設(shè)調(diào)零孔加RPMI 1640培養(yǎng)液，每孔200 μl。轉(zhuǎn)染72 h后按照說明書進(jìn)行MTT檢測。

1.2.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測 細(xì)胞分組: SKOV3/ADM、SKOV3/ADM+阿霉素、非特異轉(zhuǎn)染組+阿霉素、特異性轉(zhuǎn)染組+阿霉素。將SKOV3/ADM細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染后48 h后加0.01 mol/L阿霉素。24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍，再用-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定18 h。流式細(xì)胞儀檢測，重復(fù)檢測3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 1310軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗（組間）配對樣本t檢驗（組內(nèi)）處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Twist-siRNA的鑒定和定量 Twist-siRNA經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，其產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)兩條帶，條帶的位置與設(shè)計相符。質(zhì)粒的測序結(jié)果證明插入片段的序列完全正確。將合成的siRNA稀釋后測定260 nm的吸光度值提示合成的siRNA產(chǎn)量在200～380 μg/ml之間。

2.2 RNA干擾前后SKOV3/ADM細(xì)胞中Twist基因的轉(zhuǎn)錄水平 各組細(xì)胞在相對于262 bp處均見擴增條帶，且在100 bp以上處可見內(nèi)參β-actin的條帶，各組間其亮度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。用Band Scan圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組、非特異轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與非轉(zhuǎn)染組比較，pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Twist mRNA的抑制率達(dá)45.5 %。

2.3 pTWIST-shRNA 對細(xì)胞Twist蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法顯示，pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Twist蛋白表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和非特異性轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而空載體轉(zhuǎn)染組、非特異性轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 MTT檢測各組細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)抑制濃度 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入各組細(xì)胞，并暴露于阿霉素48 h后，各組細(xì)胞存活率均隨阿霉素濃度的增加而降低，其中特異性轉(zhuǎn)染組降低最為顯著。非轉(zhuǎn)染組SKOV3/ADM的IC50（16.54±0.23） μg/ml，其親本細(xì)胞SKOV3為（6.04±0.11） μg/ml，測其耐藥指數(shù)約為2.8，與該耐藥細(xì)胞株所屬醫(yī)院提供的數(shù)值相符；pTWIST-shRNA轉(zhuǎn)染后的SKOV3/ADM細(xì)胞對阿霉素的敏感性提高了約2.5倍，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與其他兩組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、非特異性轉(zhuǎn)染組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 pTWIST-shRNA對SKOV3/ADM周期和凋亡的影響 經(jīng)阿霉素作用后，特異性轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例都明顯高于空白對照組、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、非特異轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而S期細(xì)胞所占比例顯著低于后三者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對照組、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、非特異轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞周期分布及凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

卵巢癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃、食道而居第三位，在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占第二位，僅次于胃癌。我國每年死于卵巢癌約11萬人，占全世界卵巢癌死亡人數(shù)的45%。根治性切除者五年生存率達(dá)53.0%，其中多為小卵巢癌或大卵巢癌縮小后切除者，姑息性切除僅12.5%，藥物治療少見生存5年以上者。治療的難點為卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及對化療藥物——尤其是一線化療藥阿霉素、順鉑等產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重阻斷了化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)，從而導(dǎo)致綜合治療的失敗。而耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性降低有關(guān)^［3，4］。國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者主要采用RNAi技術(shù)對多藥耐藥基因MDR^［5］、核苷酸切除修復(fù)家族成員ERCC1等基因進(jìn)行研究，對Twist的研究較少。

Twist是轉(zhuǎn)錄因子家族中編碼鋅指蛋白的基因，與細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，并在多數(shù)惡性腫瘤中過度表達(dá)^［1，2］。另外，抑制Twist表達(dá)增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性^［3，4］。本實驗針對Twist基因設(shè)計的特異性序列與質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo連接為重組質(zhì)粒pTWIST-shRNA，轉(zhuǎn)染入卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/ADM，研究RNAi技術(shù)對SKOV3/ADM中Twist基因表達(dá)和凋亡的影響，及耐藥細(xì)胞株對化療藥物阿霉素的敏感性的變化，證實RNAi技術(shù)可以從多方面抑制Twist基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)SKOV3/ADM對化療藥物的耐藥性。

3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 選取Twist基因cDNA 序列起始點280個核苷酸之后的連續(xù)19nt作為RNA干擾的特異性序列，設(shè)計為能表達(dá)其發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小RNA（shRNA）的DNA序列，兩端加上BamHI、HindⅢ酶切位點，兩條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈，與線性化質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo連接，取名為pTWIST-shRNA。克隆后重新提取質(zhì)粒pTWIST-shRNA，經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后測序，其序列與所設(shè)計的特異性序列相符，證明特異性質(zhì)粒重組成功。

3.2 RNAi技術(shù)逆轉(zhuǎn)SKOV3/ADM細(xì)胞阿霉素耐藥的機制 本實驗是將針對Twist設(shè)計的雙鏈RNA寡核苷酸導(dǎo)入SKOV3/ADM，其與TWIST基因的mRNA互補結(jié)合并使之降解，沉默Twist基因，降低其在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了耐藥細(xì)胞株對阿霉素的耐藥性。

3.3 靶向Twist基因的小干擾RNA對SKOV3/ADM細(xì)胞凋亡的影響 研究表明RNA干擾有很強的抑制目的基因的作用^［6］，比反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更強。多種腫瘤利用此方法對Twist基因的靶向進(jìn)行了研究，被干擾的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制、凋亡增加、侵襲性下降及對化療藥物敏感性增強的現(xiàn)象^［1～4］。上述研究均為筆者將Twist基因作為基因治療靶，特異性誘導(dǎo)卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)其化療耐藥性提供了有力的理論依據(jù)。

綜上所述，RNA干擾技術(shù)有效地調(diào)節(jié)SKOV3/ADM細(xì)胞中Twist基因的表達(dá)，能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，成為抗腫瘤基因治療的新方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2011-04-06）

（本文編輯：車艷）