溫度控制對培養流感病毒細胞的影響

從機體中取出組織或細胞，模擬機體內的生理條件在體內外進行培養，使之生存和生長，稱之為組織培養［1］。因近來發現，用組織培養細胞所分離到的流感病毒，其抗原性和基因特性要比用雞胚分離到的更接近原始采集的標本，故世界衛生組織號召大家尋找合適的細胞來制備流感病毒疫苗，來代替雞胚制備疫苗［2］。

資料與方法

材料：生長成片的MDCK細胞。T-75細胞培養瓶，頸口有傾角。D-MEM培養液：青、鏈霉素母液(10000U/ml青霉素G；10000μg/ml硫酸鏈霉素)，分裝后保存于-20℃。HEPES緩沖液，1M母液。胎牛血清，40nm濾過。EDTA-胰酶(005%胰酶；053mM EDTA 4Na)，分裝后保存于-20℃，牛血清白蛋白組分V，75%溶液。1ml、10ml無菌移液管。70%～75%的酒精。待測毒株：紅細胞懸液(雞、豚鼠，由于“O”相毒株不能凝集雞紅細胞，所以在對該類病毒進行鑒定時應使用豚鼠紅細胞)。磷酸緩沖液(PBS)，001M，pH 74(Sigma P 3813)。多道及單道可調加樣器單通道可調加樣器量程20～200μl、200～1000μl，8通道或12道可調加樣器量程20～200μl。孔微量板：雞紅細胞選擇“V”型或“U”型底微量板；豚鼠紅細胞選擇“U”型底微量板。其他耗材，200μl、1000μl滴頭、試管、加樣槽等。

方法：①細胞的傳代：這里以T-25細胞瓶單層培養為例，敘述MDCK細胞的培養程序。用于細胞培養的培養基、胰酶等，37℃回溫后，用70%～75%酒精擦拭后放于生物安全柜內［3］。棄培養液，加1ml預先37℃溫浴的EDTA-胰酶使其均勻分布在整個細胞薄層，37℃孵育細胞瓶直至細胞從塑料表面分離(5～10分鐘)。必要時可以搖動或吹打來分離細胞。加10ml完全型D-MEM，輕輕上下移動移液管來分散細胞團。一般情況下，1瓶細胞傳3瓶，每2～3天需傳1代。②MDCK細胞保存及復蘇：MDCK細胞對流感病毒的敏感性隨其代數增加而下降，故各實驗室應液氮凍存代數較低的細胞作為種子。一般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。首先進行細胞消化，消化過程同細胞培養的消化。細胞消化后，加入配置好的細胞凍存液，混勻后分裝到細胞凍存管內。細胞凍存濃度1×106。MDCK細胞保存：將單層細胞消化分散成為單細胞，加入09ml小牛血清和01ml二甲基亞砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，緩慢凍存：先放4℃ 2小時，轉放-70℃ 4小時，再轉放液氮中長期保存。MDCK細胞復蘇：將細胞生長液放入37℃回溫，回溫后以70%～75%的酒精擦拭，放入生物安全柜(無菌的操作臺)內，自-70℃或液氮中取出細胞凍存管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程蓋子容易松掉，立即放入37℃水浴中快速解凍，輕輕搖動使其在1分鐘內全部融化，以70%～75%的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜(無菌操作臺)，取出10ml解凍的細胞懸液，緩慢加入有生長液的細胞培養瓶內，混合均勻，放入培養箱培養，次日更換細胞生長液。③紅細胞凝集試驗：根據所用的紅細胞種類選用適當的微量板。將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1～H1稱為第1列；平行方向稱行，如A1～A12稱為A行。標記好待檢病毒的實驗室編號及加樣順序。多道加樣器裝好200μl帶濾芯滴頭，于加樣槽中吸取50μl PBS加入微量板的第2列，依次加入50μl PBS直至最后1列。加入待檢病毒，單道加樣器裝好200μl帶濾芯滴頭，吸取100μl待檢病毒液，加入已標記好的微量板的第1列相對應的孔內。最后的H1孔內加100μl PBS作為紅細胞對照。多道加樣器裝好200μl帶濾芯滴頭，從第1列的各孔分別取50μl病毒液，加入到第2列的相應的各孔，混勻數次。依次從微量板的第2～12列做2倍系列稀釋。最后1列每孔棄去50μl液體。多道加樣器裝好200μl帶濾芯滴頭，于加樣槽中吸取50μl紅細胞懸液。每孔加入50μl 1%的紅細胞懸液，輕彈微量板，使紅細胞與病毒充分混合。室溫孵育30～60分鐘，觀察紅細胞凝集現象并記錄結果。

結果判定：紅細胞凝集滴度的判定以出現完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數即為病毒的紅細胞凝集滴度。紅細胞完全凝集以“+”記錄；無凝集或部分凝集“-”記錄。

結果

選擇經不同溫度保存后恢復正常生長狀態的細胞與未曾改變生長溫度的細胞，同時接種已知滴度流感病毒陽性毒株，3天后收獲病毒液，檢測病毒HA滴度，測試病毒培養效果，見表1。

討論

在病毒分離實驗中，由于病毒生長情況不確定，病毒傳代的次數也不確定，因此對細胞的需求會經常發生變化，暫時不需要的細胞可以通過傳代來保存，但頻繁的傳代不但會降低細胞的使用壽命，而且會產生的過量細胞，造成不必要的資源浪費。用溫度來控制細胞的生長速度，使細胞放緩生長或停止生長，是解決這一問題的最好的方法。

采用溫度調節來控制細胞的生長速度，不但為實驗操作提供了方便，可以隨時獲得培養好的細胞，即時分離病毒，而且極大地節省了資源，細胞培養的費用很高，培養瓶及一些必要的試劑價格比較昂貴，采用這種方法在實驗過程中既方便實施又可以達到理想的效果。

參考文獻

1王秀茹，主編.預防醫學微生物學及檢驗技術.北京:人民衛生出版社，2002.

2桂芳，張卓然，薄志堅，等.用MDCK細胞培養副流感病毒的初步嘗試［J］.醫學理論與實踐，2005，10(3):8-9.

3劉建軍，程小雯，賀連華，等.用雞胚和MDCK細胞分離流感病毒的實驗研究［J］.中國公共衛生，2002，3(2):83-84.