皮膚角質層粘貼技術及其應用

角質層在表皮的最表層，由多層扁平的角質細胞組成。這些細胞是已經完全角化的細胞，核和細胞器都已消失。在HE染色切片上呈均質伊紅色，細胞輪廓不清，最表面的細胞連接松散，趨向脫落，即稱為鱗屑。角質層粘貼技術，是用涂有粘性材料的膠帶、圓盤或者玻片粘貼皮膚，作用于表皮角質層的粘附力可使鱗屑脫落，從而觀察角質層的生理和病理學變化，此技術被廣泛用于藥物、化妝品的動力學研究和觀察活性物質的滲透深度[1]。本文對常用的幾種角質層粘貼材料、粘貼技術、臨床應用等作一綜述。

1 角質層粘貼材料

1.1 D-SquameR粘貼盤：D-SquameR(Cuderm Corp， Dllas， TX， U.S.A.) 粘貼盤，由透明聚酯薄膜構成的小圓盤，上面覆蓋壓力敏感粘合劑。在一定壓力（10～25kPa或100～250g/cm2）下將D-SquameR盤粘在皮膚測試部位并持續一定的時間（5、10、30s），移去D-SquameR盤，一些鱗屑粘附在上面。膠帶粘取角質層數量的多少受多種因素的影響，例如膠帶粘貼的方式、次數、粘貼施加的壓力、時間、皮膚的含水量、皮膚角質層細胞之間的內聚力、不同的身體部位和個體差異[2-4]。

1.2 CorneofixR ：CorneofixR（Courage+Khazaka GmbH， Cologne， Germany）一種透明聚酯薄膜膠帶，膠帶的一側有個延伸出來的手柄，方便操作者持捏，而不污染粘貼鱗屑的待測部位。膠帶可以根據測試部位的面積剪取不同的大小，準備測試部位后把膠帶的粘著面與皮膚接觸，用手指輕輕滾動按壓膠帶，并停留5s、10s、30s，以均勻的速度撕去膠帶，一些鱗屑粘附在上面。該方法容易受到外界物質，如頭發、灰塵等影響，因此采集到的貼片應立即分析或者保存完整再分析。

1.3 其他：BlendermR(3M Deutschland GmbH， Neuss， Germany)，是一種外科常用的透明膠帶，透過膠帶可觀察傷口的變化，并且不受手指和手部的運動限制，它適用于持續很長一段時間。還有學者用TransporeR(3M， St. Paul， MN，USA，batch no.2002-12 AP)和MicroporeR(3M，St.Paul， MN，USA，batch no.2001-08 AN.)等膠帶進行研究[2，5]。

2 膠帶粘貼角質層分析技術

2.1 視覺評估：根據膠帶粘附的鱗屑密度對照標準評估背景卡作視覺評估，此方法簡單、快捷，但只適合通常的主觀評分，不能用來測量實際的脫落量，也不能衡量粘附鱗屑的分布情況[6]。

2.2 定量分析法：根據膠帶粘附的鱗屑計算其面積，也可以通過光反射來定量反映鱗屑的量。有研究者利用計算機分析D-SquameR粘貼盤所捕捉的鱗屑的圖像視頻，并用三個參數來描述，分別為SURFP（粘貼盤的黏附面積）、SMOD（平均光反射）、HI（異質性指數，即鱗屑平均密度）[7]。此種利用計算機分析D-SquameR粘貼盤上鱗屑參數的技術彌補了臨床肉眼視覺評估的不足，并能夠很敏感地反映皮膚鱗屑的變化及皮膚含水量的變化。CorneofixR膠帶所粘取的鱗屑，利用VisioscanR（VC98，C-K electronics， Koln， Germany）采集、分析，并得出相關鱗屑參數，然后結合SELS（Courage+Khazaka GmbH， Cologne， Germany）系統自動化分析視頻圖像。CorneofixR參數包括：PA（完全覆蓋于正常角質層細胞的面積百分比）、AI（每平方毫米所完全覆蓋的正常角質層細胞）、DI（脫屑指數，根據不同角質形成細胞的分布來計算）[8]。

2.3 光學立體成像技術分析法：有學者研制出一種新型的成像裝置（Corneosizer）無創觀察、分析皮膚角質形成細胞的特征[9]。該裝置利用落射熒光顯微鏡技術，原理是鹵鎢燈產生的光線在485nm過濾后通過分光鏡聚焦在帶有10倍物鏡成像光纖束的近端，熒光再被同一成像光纖束收集后，通過上述分光鏡再在503nm過濾。帶有計算機支持的多組線性電荷耦合器件（charge coupled device， CCD）感應器的相機可在數秒內獲取熒光圖像。該技術安全、無創、使用簡單，能在大多數皮膚表面應用，研究者能較容易操作軟件并選擇目的皮膚區域，能更加清楚觀察不帶毛發的皮膚區域的角質形成細胞（如唇紅部位），并能快速成像測定角質形成細胞的大小。

2.4角質層細胞的分離與保存：將撕下的膠帶用膠帶切割機切割成1cm2的大小。1cm2的膠帶放入1.5ml聚丙烯的管中，加入1.5ml的二甲苯溶液。10min后，用鑷子把膠帶從管中除去，在3000rpm的離心機中離心5min，棄掉上清。然后向管中加入100%的乙醇1.5ml。乙醇懸濁液里，角質細胞呈現為白色沉淀物。再一次離心3000rpm 5min，棄掉上清。為了讓殘留的乙醇蒸發掉，將沉淀物在減壓下干燥，從而分離出角質細胞。此時，用顯微鏡觀察角質細胞時，可用1%結晶紫與0.5%亮綠的混合液染色5min，用水洗凈。分離出的角質細胞可以進一步分析其細胞結構和蛋白質。分離后如果暫時不使用，可以將樣品保存在-20℃的環境下，待后期分析[10]。

2.5 多種生物標記物和細胞因子的定量分析：生物標記物主要有皮質醇、可溶性纖維連接蛋白、人血清白蛋白、內披蛋白、不可溶性的角蛋白6、1、10、11等。表皮蛋白質主要分為角蛋白和角蛋白中間絲相關蛋白。角蛋白是角質形成細胞的主要結構蛋白，呈纖維狀，直徑約為10mm，屬于中間絲家族。根據角蛋白基因核酸序列的同源性將其分為兩型，Ⅰ型分子量較小，呈酸性，Ⅱ型分子量較大，呈堿性。成熟的角蛋白纖維是由Ⅰ型和Ⅱ型以1:1比例聚合而成的異種二聚體，因此，在表皮中角蛋白是成對表達的。角蛋白對的表達，即分化特異性K1/K10。角蛋白基因的正確表達和角蛋白細胞骨架的完整構建是表皮物理屏障功能結果的基礎。在表皮細胞向終末分化的過程中，還涉及一些重要的中間絲相關蛋白，如絲聚合蛋白，兜甲蛋白，內披蛋白，角質形成細胞轉谷酰胺酶，小分子富含脯氨酸蛋白等。主要催化角質套膜蛋白的內披蛋白等，形成異常不溶性角質套膜，為表皮獨特的角質層屏障結構。測定膠帶所粘取的角質層蛋白，由膠帶粘取后的鱗屑放入玻璃小瓶中，然后加入4ml甲醇，振蕩1h，棄掉上清，把甲醇徹底蒸發，再加入4ml 1M的NaOH，振蕩離心2h后在室溫過夜。角質層總蛋白質或者可溶性蛋白質的含量測定用Bio-Rad公司的蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA， USA)，使用牛血清白蛋白作為標準，空白的膠帶作為對照。細胞因子的測定，先加入2ml磷酸鹽緩沖液和0.005%Tween-20于每個玻璃硅烷樣品瓶中，然后每個小瓶放在冰塊冷卻30min。使用帶有探針的超聲裝置在冰水中提取15min。提取液離心1min和225ml的上清分裝被重新凍結在-80℃，直到需要進一步的分析。提取物分析細胞因子（IL- 1α、TNF-α， IL8， IL1RA， and IL10）使用特定的酶聯免疫吸附試驗試劑盒[11]。

3 角質層粘貼技術在皮膚科的臨床應用

角質質粘貼技術在皮膚科臨床診斷、治療標準及化妝品無創評價領域有廣泛的應用，現在越來越受到皮膚科醫生及化妝品研究人員的關注。

3.1 皮膚干燥類疾病：針對干燥性皮膚病的患者，醫生可采用角質粘貼技術測量不同部位的鱗屑變化、角質層鱗屑參數的顯著減小來反映藥物或者保濕產品的療效。比如銀屑病的患者，現在有許多學者采用D-SquameR或者CorneofixR膠帶粘取皮膚鱗屑標本，行蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下計數角化不全細胞數[6]。根據客觀測量角化不全細胞數目的多少評分，結合之前觀察者主觀評判銀屑病皮損面積和嚴重程度指數，完善而又相對準確的判斷銀屑病嚴重程度及病情變化，指導臨床合理用藥。有研究者研究醫護工作人員的手部和前臂皮膚的角質層細胞因子和結構蛋白的變化，醫護人員的手部長時間重復性的暴露在醫療環境中及頻繁清潔手部皮膚，得出其手部皮膚的角質層細胞因子和結構蛋白明顯比前臂皮膚減少的結論[12]。

3.2 皮膚屏障缺陷類疾病：在面部皮炎（如玫瑰痤瘡）的患者中，其皮膚屏障功能有較明顯的缺陷，與正常皮膚相比，面部皮炎患者發生過敏或者刺激反應的概率很高。那么皮膚屏障受損后，使得角質層內的絲氨酸蛋白活性增強。那么，就有學者利用膠帶粘貼技術對面部皮炎患者的病變部位進行粘脫，分析其角質層的絲氨酸蛋白活性和量化表皮抗菌肽cathelicidin的含量，從而研究氨甲環酸（絲氨酸蛋白抑制劑）的皮膚屏障修復功能。同時，角質粘貼技術可以用于破壞皮膚的屏障，利用膠帶多次粘貼角質層后，造成皮膚屏障破壞，然后于不同次數粘貼后測定皮膚角質層的含水量、經皮失水（TEWL）、pH、皮膚顏色、油脂等參數，觀察其與正常皮膚的變化[2，13]。

3.3 皮膚細菌、真菌類疾病：皮膚細菌、真菌感染患者就診時，醫生可采用膠帶取皮膚鱗屑標本，用于細菌、真菌鏡檢、培養和分析，從而確定診斷及治療方案。有學者用D-SquameR圓盤在六條健康犬的耳廓處粘取角質層，圖像分析量化膠帶所粘取的真菌數量[14]。在皮膚科臨床診斷中，比如痤瘡、酒渣鼻等患者，醫生都會建議患者進行細菌或者毛囊蟲的檢查，即可用膠帶法粘貼，然后鏡下觀察。

3.4 內分泌類疾病：有學者利用96例皮膚外觀正常的糖尿病患者和83例非糖尿病患者作對照，比較皮膚的脫屑率[15]。利用D-SquameR圓盤粘取糖尿病患者的皮膚角質層，然后用照片分析技術定量評估膠帶鱗屑值，鱗屑的光反射量代表了鱗屑的量，單一的反射代表鱗屑的大小和分布，從而觀察糖尿病患者與非糖尿病患者的角質層脫落率的變化。

4 角質層粘貼技術在化妝品中的應用

4.1 保濕類化妝品的功效評價：皮膚鱗屑的產生是人體皮膚干燥的一個反映，通過利用角質粘貼膠帶采取鱗屑樣本來評價保濕產品的功效性已經被廣泛應用[6，16]。所取的鱗屑樣本在黑色的背景下觀察白色的鱗屑，然后在兩個對立相反的氙氣燈源下觀察，提供了一個更加均勻的光源環境，而且降低了多余的光源干擾。樣本所反射的光在50倍的放大鏡下捕獲視頻，然后連接到計算機系統，軟件圖像采集、存儲、分析。最后通過計算機軟件計算SURFP、SMOD、HI三個參數，從而比較使用保濕產品前后皮膚的鱗屑參數變化[7]。

4.2 抗皺類化妝品的滲透力度：皮膚的溝紋、皺紋是人體皮膚的典型結構，通過觀察皮膚的溝紋、皺紋來評價外用化妝品或藥物的滲透能力和生物利用度。使用透明膠帶膜具有很高的靈活性，膠帶激烈接觸皮膚，并施加壓力橫向移動，是先決條件，以獲得正確的數據。膠帶的應用剝離角質層觀察其剖面的結構和角質層上物質分布。實驗結果表明，膠帶剝離角質層過程是一個有價值的技術，定量反映抗皺類化妝品進入人體角質層剖面的滲透力度和生物利用度[17]。

4.3 去屑型洗發護發產品的功效評價：有學者用一個隨機雙盲臨床試驗對兩個組30名診斷為中度至顯著頭屑的受試者進行觀察，兩組分別使用非焦油類洗發水（含水楊酸、硫磺、吡啶硫酮鋅、酮康唑等物質）和0.5%焦油類洗發水。使用透明膠帶膜粘貼頭皮屑，比較兩種洗發水的去屑效果及抗馬拉色菌的效果。實驗發現非焦油類洗發水和0.5%焦油類洗發水的去屑效果一致，但是前者的抗馬拉色菌效果更強[18]。

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[收稿日期]2012-01-17 [修回日期]2012-03-13

編輯/李陽利