胰島素樣生長因子-2在嬰幼兒血管瘤中的表達及意義

[摘要]目的：探討胰島素樣生長因子-2在不同年齡、不同病理分期嬰幼兒血管瘤中的表達水平及意義。方法：采用免疫組化SP法檢測50例嬰幼兒血管瘤、27例血管畸形及5例正常皮膚組織中 IGF-2的表達。應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。結果：免疫組化結果顯示：嬰幼兒血管瘤組和血管畸形組IGF-2的陽性表達率比較，差異具有統計學意義（χ2=7.46，P<0.05）；嬰幼兒血管瘤組和正常皮膚組IGF-2的陽性表達率比較，差異具有統計學意義（χ2=9.41，P<0.05）；IGF-2蛋白的表達水平在血管畸形組織中與正常皮膚組織中的差異無統計學意義(χ2=0.0333，P>0.05)。嬰幼兒血管瘤患兒年齡與IGF-2蛋白的表達強度的相關分析，線性回歸分量和非線性回歸分量均有統計學意義(P值均<0.05)。嬰幼兒血管瘤的年齡與腫瘤病理分期有關系（χ2=24.91，P<0.05）。IGF-2蛋白的表達強度和病理分期有關系（χ2=19.03，P<0.05）。結論：嬰幼兒血管瘤中IGF-2蛋白的表達強度、腫瘤的病理分期和患兒年齡兩兩間存在關聯。IGF-2可能在嬰幼兒血管瘤的發展過程中起促進增殖的作用。IGF-2蛋白的表達狀況能在一定程度上反映瘤體的發展趨勢。

[關鍵詞]胰島素樣子生長因子-2；嬰幼兒血管瘤；免疫組化

[中圖分類號]R732.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）05-0769-04

Signification of IGF-2 protein expression in infantile hemangioma

HUANG Qiao-ling1，FENG Xiao-ling2

（1.Department of Plastic Surgery，Wuhan General Hospital of Guangzhou Command，Wuhan 430070，Hubei，China;

2.Department of Plastic Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology）

Abstract: Objective To investigate the expression of IGF-2 in different stages of infantile hemangioma. Methods The expression of IGF-2 in different stages of infantile hemangioma was detected by Streptavidin-Peroxidase immunohistochemical method，compared with vascular malformation and nomal skin tissues. Samples of infantile hemangioma and normal skin tissue were obtained from Wuhan Union Hospital. Archived paraffin blocks of vascular malformation samples were obtained from pathology department of Wuhan Central Hospital. All cases have not received any treatment before surgical excision. Results The expression level of IGF-2 protein in infantile hemangioma is higher than those of vascular malformation and nomal skin tissues（P<0.05）. But the difference of IGF-2 protein expression levels in vascular malformation and nomal skin tissue may not be significant（P>0.05）. The expression level of IGF-2 protein，the age of patient and pathological stage of IH could corelate with each other（P<0.05）. Conclusion IGF-2 could play a significant role in the growth of infantile hemangioma，which makes it promising target for early intevention of this tumor.

Key words:insuline-like growth factor 2;infantile hemangioma;immunohistochemistry

嬰幼兒血管瘤（Infantile Hemangioma，IH）為良性先天性血管病變，在新生兒的發病率為1%～2%，1歲內高加索幼兒的發病率為5%～10%，男女發病比例為1∶3～5。約三分之一的患兒在剛出生即被發現皮膚有紅色斑點，其余大多在出生后兩周才被發現[1]。所有嬰幼兒血管瘤都表現出特有的病變過程，即瘤體增生后有一自發的緩慢消退現象[2]。顏面部的血管瘤常常會導致患兒外貌受損。一些位于特殊部位的血管瘤則會引起功能障礙，如眼瞼血管瘤會導致弱視，呼吸道的血管瘤可壓迫氣道而影響呼吸功能[3]。

目前尚沒有一種假說或者理論可將嬰幼兒血管瘤的發病機制全面闡明，這也使得此疾病無較佳的臨床治療。臨床醫師面對一歲以內的血管瘤患兒，選擇恰當的治療時機和有效的治療手段顯得尤為重要。

近年來有研究表明，胰島素樣生長因子-2 (insuline- like growth factor 2，IGF-2) 的過度表達與惡性腫瘤（如卵巢癌、結腸癌等）及其他增生性疾病聯系密切[4]。我們已經知道IGF-2 是一種有絲分裂原，具有凋亡抑制作用[5]。國外有研究人員已運用cDNA微集陣列分析方法證實IGF-2是血管瘤生長潛在的重要調節因子[6]。他們還運用人血管瘤的外植模型，顯示IGF-2促進血管瘤體的外擴生長。

本研究根據患兒年齡將嬰幼兒血管瘤病例分組，應用免疫組化SP方法，檢測不同年齡段、不同病理分期患兒瘤體組織中 IGF-2的蛋白含量，初步探討IGF-2蛋白表達強度與患兒年齡、瘤體病理分期三者間的關系和意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源：收集武漢協和醫院整形外科2009 年 3月～2011年3月間手術切取50例患兒血管瘤組織作為實驗組標本，術前均未行任何輔助性治療、單純手術切除并經病理檢查和追溯病史證實為嬰幼兒血管瘤。上述患兒同期手術時所留取的血管瘤周圍正常皮膚組織，共5例作對照。武漢協和醫院病理科存檔血管畸形石蠟標本27份。血管瘤患兒中男性24例，女性26例，年齡最小者1月齡，年齡最大者3歲齡。瘤體所在部位有頭面部、胸部、腹部、背部、四肢等。

1.1.2 材料分組：蠟塊切成4μm厚蠟片，常規HE染色后光鏡下觀察，按組織結構特點進行分期，其中增生期血管瘤標本37例，消退期血管瘤標本13例，血管畸形27例，帶血管的正常皮膚5例。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫組織化學實驗主要試劑：一抗：兔抗人IGF-2多克隆抗體，購于武漢博士德生物試劑公司；UltraSensiti veTMS-P超敏試劑盒(包含二抗，生物素標記的羊抗兔IgG)，購于福州邁新生物技術開發有限公司；DAB顯色試劑盒，購于武漢博士德生物試劑公司。

1.2.2 IGF-2蛋白的免疫組織化學染色：采用S-P免疫組織化學法，實驗操作參照說明書。PBS代替第一抗體作陰性對照。

1.2.3免疫組織化學染色結果及判斷：IGF-2以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。使用OLYMBUS-BX50手動光學顯微鏡，在40倍物鏡下，每張免疫組化切片隨機選擇不重疊的5個視野，每個視野計數至少200個血管內皮細胞，并計數陽性血管內皮細胞占內皮細胞總數的百分比。按陽性細胞百分比進行分級，陽性細胞百分率小于5%為（-），陽性細胞百分率介于5%到20%之間為（+），陽性細胞百分率大于20%為（+ +）。所有標本的紅細胞染色陽性。

1.2.4 統計學處理：各組免疫組織化學反應細胞陽性率以均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，組間比較采用卡方檢驗，有序分組資料的線性趨勢檢驗采用 分解推斷，單向有序資料采用行×列表資料的 檢驗進行分析，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果：按Mulliken分期標準，每張HE染色切片于200及400倍光學顯微鏡下觀察，對實驗標本進行分類，其中嬰幼兒血管瘤組織50例，血管畸形組織26例，正常皮膚組織5例。血管瘤組織的血管內皮細胞增殖可見，血管畸形組織以血管腔異常為特點，內皮細胞增殖少見。增生期嬰幼兒血管瘤組織可見瘤體以內皮細胞為主，圓形內皮細胞呈簇狀或團索狀，血管腔幾乎不可見。血管腔之間可見增生的“間質”細胞，少見結締組織（圖1a）。消退期嬰幼兒血管瘤血管腔明顯，內襯扁平內皮細胞，間質細胞變少，細胞外基質沉積出現，血管腔外可見多層基膜（圖1b）。血管畸形組織中血管腔異常擴張，內皮細胞扁平，無血管內皮細胞增多（圖1c）。

2.2 免疫組織化學S-P法染色結果：IGF-2以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應（圖2a～圖2d）。在增生期血管瘤中，血管內皮細胞胞漿內可見此類棕黃色顆粒，在血管間區域亦可見大量陽性反應細胞。在消退期血管瘤，陽性反應細胞主要為微血管內皮細胞。在血管畸形和正常皮膚組織，亦可見少量陽性反應細胞。

2.3 數據統計及分析：嬰幼兒血管瘤組與血管畸形組比較的 χ2=7.46，0.01

3 討論

3.1 關于嬰幼兒血管瘤的發病機制，可大致分為兩大類。一類是研究大量擴增的內皮細胞具體來源的內在理論機制，已提出的假說有以下幾種：①嬰幼兒血管瘤胎盤來源假說；②內皮祖細胞來源假說；③血管瘤干細胞來源假說；④成血管細胞來源假說。

3.2 另一大類研究外周環境因素在血管瘤發生發展過程中所起作用的，目前已提出的影響因素主要有：①雌激素水平異常；②局部低氧分壓與缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)；③能分泌細胞因子的間質細胞；④影響細胞凋亡的基因表達異常。

3.3 上述因素中VEGF被認為是最關鍵性因子之一。現已知VEGF與內皮細胞上的VEGF受體結合后，能引起血管內皮細胞分裂、增殖和遷移，促進新生血管形成[7]。VEGF在新生血管形成的早期起促發作用，通過招募外周細胞和平滑肌細胞促進毛細血管節段和完整血管壁的形成。影響 VEGF 表達的因素有缺氧、癌基因、多種生長因子等[8]。

3.4 近年來，隨著對胰島素家族研究的不斷深入，人們認識到胰島素家族不僅與糖尿病的發生關系密切，而且與腫瘤的發生也有著密切聯系[9]。胰島素家族與VEGF促血管新生作用之間的關系逐漸受到人們的重視。胰島素家族是一類重要的生長因子，包括胰島素、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、相應的受體和結合蛋白[10]。IGF-2蛋白是由67個氨基酸組成的單鏈弱酸性多肽，分子量為7144KD。Kawamoto等研究發現，IGF-2在人胎兒時期的含量遠比成年期高，且出生后IGF-2的表達主要在肝臟、神經組織等[11]。

3.5 IGF-2能與兩種不同的受體即胰島素樣生長因子受體Ⅰ（insuline-like growth factor receptor Ⅰ，IGF-ⅠR）和胰島素樣生長因子受體Ⅱ（insuline-like growth factor receptor Ⅱ，IGF- ⅡR）結合 ，通過自分泌和旁分泌方式發揮其生物學作用。Matthias Neid等[12]的研究證實，IGF-ⅠR能上調胰腺癌細胞上VEGF的表達，作為IGF-ⅠR兩個主要下游分子的胰島素受體底物-1和-2在促腫瘤血管新生中起到重要作用。其可能通過以下作用途徑促進血管生成：①誘導缺氧誘導因子-1α的合成，后者再促進VEGF的轉錄[13]；②促進VEGF（主要是VEGF-A）及其相應受體（主要為vascular endothelial growth factor receptor-2， VEGFR-2）的結合，兩者結合后在下游靶點的酪氨酸磷酸化、細胞Ca2+穩定、NO產生、血管內皮細胞增殖、移行等方面發揮作用。

3.6 Ritter等學者報道IGF-2可能在血管瘤生長調節中起重要作用[14]。他們在2002年運用cDNA微集陣列分析方法發現增生期血管瘤中IGF-2蛋白表達增強。他們還運用人血管瘤的外植模型，顯示IGF-2促進血管瘤體的外擴生長。他們的研究還顯示，IGF-2在嬰幼兒血管瘤體中表達的上調與血管內皮細胞生長因子受體-2表達水平相關。

3.7 本實驗通過免疫組織化學方法觀察到，IGF-2蛋白的表達水平在嬰幼兒血管瘤組與正常皮膚組比較，P<0.05，差異具有統計學意義。這說明血管瘤組織中IGF-2蛋白的表達是有別于正常皮膚組織血管內皮細胞的“基礎”表達水平的。IGF-2蛋白是一種有絲分裂原，能抑制細胞凋亡，可認為它在嬰幼兒血管瘤中的高表達可能起到了促進血管內皮細胞增殖的作用。

3.8 IGF-2蛋白的表達水平在嬰幼兒血管瘤組織與血管畸形組織比較，P<0.05，差異具有統計學意義。可認為IGF-2蛋白在嬰幼兒血管瘤組織中的表達水平高于在血管畸形組織中的表達水平。血管畸形組與正常皮膚組比較，P>0.05，認為IGF-2蛋白在血管畸形組織與正常皮膚組織中的表達差異不具有統計學意義。但YING YU等[30]的研究顯示：IGF-2在增生期和消退期嬰幼兒血管瘤中均高表達，在血管畸形及正常嬰兒皮膚組織中未檢出。導致本實驗與他們研究結果差異的原因可能是：①正常皮膚組織組取材于血管瘤周圍皮膚組織，體內激素水平影響及臨近血管瘤瘤體細胞分泌作用均可導致其內IGF-2蛋白水平升高；②本實驗正常皮膚組和血管畸形組樣本例數較少。

3.9 從表2中可看出：1歲以內的患兒在4～6月年齡段血管瘤內IGF-2蛋白的表達最強，6月齡后隨患兒年齡增大IGF-2蛋白的表達強度減弱，1～3歲年齡段IGF-2蛋白表達水平接近陰性。對其進行線性趨勢相關分析，總變異、線性回歸分量、偏離線性回歸分量P值均<0.05，線性回歸分量和非線性回歸分量均有統計學意義，說明年齡與IGF-2蛋白的表達強度相關，但非簡單的直線關系。

3.10 表4為嬰幼兒血管瘤年齡和病理分期的比較，應用 檢驗，P<0.05，說明嬰幼兒血管瘤的年齡與病理分期有關系。列聯系數C=0.577，說明年齡和病理分期的關系較密切。可以推論：隨著患兒年齡增加，瘤體進入消退期的可能性增大。這從一定程度上佐證了嬰幼兒血管瘤的臨床演變特點：1歲左右進入消退期，持續4～6年。嬰幼兒血管瘤的藥物干預治療應在盡早進行。

IGF-2蛋白表達強度在嬰幼兒血管瘤增生期組與消退期組中的比較，應用 檢驗，P<0.05，說明嬰幼兒血管瘤的病理分期與IGF-2蛋白表達強度有關系。列聯系數C=0.525，說明IGF-2蛋白的表達強度和病理分期的關系較密切，即IGF-2蛋白的表達程度越高，血管瘤處于增生期或向增生期發展的可能性越大；IGF-2蛋白低表達時，瘤體處于消退期或往消退期發展的可能性越大。

3.11 綜合表2～5的結果，可以得出結論：①嬰幼兒血管瘤中IGF-2蛋白的表達強度、腫瘤的病理分期和患兒年齡兩兩間存在關聯；②嬰幼兒血管瘤的干預治療應盡早，一般宜在瘤體處于增殖早期或1歲以內時進行；③ IGF-2蛋白的表達狀況能在一定程度上反映瘤體的發展趨勢。在評估嬰幼兒患兒的病情和作出治療選擇時，IGF-2蛋白可能為一有意義的參考因素。

3.12 在本實驗HE染色切片中，增生期血管瘤組織中增殖細胞不僅分布于血管管腔區域，在血管之間的區域亦明顯可見廣泛分布。SP染色切片，見在血管間區域的大量細胞中也有棕黃色顆粒的表達。我們推測，在增生期血管瘤中除了血管內皮細胞還有許多其他細胞增殖，其具體類型和機制尚待進一步研究。

3.13 在后續的工作中，我們可以進行更深入的研究，將1歲以內各個月齡的嬰幼兒血管瘤瘤體內IGF-2蛋白的表達進行定量分析，以明確IGF-2蛋白的表達與年齡及病理分期的關系，為嬰幼兒血管瘤早期藥物干預治療的時間選擇提供理論支持。本研究對于1歲以內該類患兒的低創、有效的治療方案的制定有一定的參考意義。

總之，我們有理由相信--進展性血管瘤的干預性治療是可能的，IGF-2或其受體有望作為早期干預的有效靶點。

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[收稿日期]2011-12-17 [修回日期]2012-02-12

編輯/張惠娟