組織工程骨-軟骨復合組織種子細胞的獲取與培養

[摘要]目的：探索體外培養組織工程骨-軟骨復合組織種子細胞的條件，并觀察其部分生物學活性。方法：采用機械-酶消化法對3周齡新西蘭大白兔耳軟骨和關節軟骨消化來獲得軟骨細胞，采用全骨髓貼壁法來獲得骨髓間充質干細胞，對兩種細胞進行原代和傳代培養，通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態、繪制生長曲線、免疫組化染色等對細胞進行生物學特性分析。結果：原代培養的軟骨細胞以多角形或三角形為主，傳代3次以后出現去分化。形態學和免疫組化顯示細胞3代以內可以保持表型穩定，具有較強的增殖及分泌細胞外基質的能力，而且耳軟骨及關節軟骨細胞在實驗中沒有表現出明顯的生物學差別。采用貼壁篩選法獲得的BMSCs呈長梭形或多邊形，生長曲線呈“S”形，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，細胞生長增殖能力旺盛。結論：體外分離培養的軟骨細胞和骨髓間充質干細胞符合組織工程要求，能夠作為骨-軟骨復合組織的種子細胞。

[關鍵詞]組織工程；骨髓間充質干細胞；軟骨細胞；種子細胞

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）05-0748-04

Obtainment and culture of seeding cells of tissue engineered osteochondral composites

LIU Peng1， FU Chong-jian1， DENG Tian-zheng2， JIANG Ming1， LI Ji-guo1， YU Shu-juan1， ZHU Guo-xiong1

(1.Department of Stomatology， Jinan General Military Hospital， Jinan 250031，Shangdong，China;2.Department of Stomatology， General Hospital of the Air Force of PLA)

Abstract: Objective To explore the optimized conditions for isolation and culture of seeding cells of osteochondral composites and observe some biological features of the seeding cells. Methods 3-week-old New Zealand White rabbits were selected for BMSCs and chondrocytes isolation and culture. Articular cartilage cells were obtained by mechanical-collagenase digestion. BMSCs were saparated using whole marrow culture method and purified by attachment method. Morphology and growth characteristics were observed. Results The cultivation of cartilage cells presented with polygonal or triangle， morphology and immunohistochemistry showed that stable phenotype could be maintained within three generations， and the biological characters of chondrocytes from ears or joints were almost the same. BMSCs developed a spindle or polygonal appearance， growth curve was S-shaped， expression of type Ⅱcollagen was positive. Adhesive culture method was proved to be an effective method to provide a large number of BMSCs. Conclusion The chondrocytes and BMSCs are suitable for tissue engineering， and these can be used as seeding cells of osteochondral composites.

Key words: tissue engineering; bone marrow stem cells; chondrocytes; seeding cells

骨-軟骨復合組織主要存在于關節、肋骨等區域，尤其是顳下頜關節、膝關節等運動關節，并承擔著重要的功能。各種原因導致的關節軟骨缺損是常見疾病，由于關節軟骨自身修復能力有限，目前無特效治療方法[1]。近年來組織工程的發展為治療軟骨缺損帶來了良好的前景[2]。種子細胞、支架材料和生長因子是組織工程的三大要素，種子細胞的選擇是組織工程化骨-軟骨復合組織構建的前提。本研究選擇了軟骨及骨髓來源的細胞，通過對軟骨細胞和骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）的分離方法、培養條件及生長測定，來建立一種快速、簡便、可靠的種子細胞分離培養方法，為下一步實驗打下基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和實驗分組

3周齡新西蘭大白兔，雄性，體重0.4kg，由濟南軍區總醫院實驗動物中心提供。根據取材部位不同分為：耳軟骨組（A），關節軟骨組（B），BMSCs組（C）。

1.2 兔軟骨細胞的分離和培養

動物麻醉處死后，無菌條件下切取雙側耳廓，分離含完整關節的四肢長骨，剝去皮膚及軟骨膜，剪成小米粒大小軟骨粒，磷酸鹽緩沖液（PBS）反復浸泡沖洗兩遍，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶消化0.5h，中間吹打一次，用相同體積的胎牛血清中止消化，800r/min離心5min，棄上清，加入兩倍體積的Ⅱ型膠原酶37℃恒溫搖床消化過夜后，100目篩網過濾，離心，沉淀細胞用PBS洗滌打散2次，以含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300μg/ml，維生素C50μg/ml，青、鏈霉素100U/ml的DMEM/F12培養液制成細胞懸液，計數板計數細胞，臺盼藍染色檢查細胞活力，分別以5×106/ml密度（高密度）和1×106/ml密度（低密度）接種于培養瓶中，置37℃，飽和濕度，5%CO2培養箱內。待細胞貼壁后換液，每2～3天天換液1次，顯微鏡下觀察細胞生長情況情況，當細胞生長匯合成片，約90%融合時，加入0.25%胰蛋白酶進行傳代培養。

1.3 兔BMSCs的分離培養：無菌條件下獲得的兔股骨和肱骨，用培養液將骨髓腔內骨髓組織完全沖出，置于肝素化的無菌離心管中。在離心管中加入DMEM/F12培養液，混勻制成細胞懸液，1 000r/min離心5min，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，重新混勻，反復洗滌2次，離心后棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，混勻重懸細胞后計數細胞，臺盼藍染色檢查細胞活力。細胞以2×106/ml密度接種于培養瓶中，置37℃，5%CO2，飽和濕度培養條件下培養2天進行首次換液，輕輕搖動培養瓶去除未貼壁懸浮細胞。以后每隔2天換液，約7天后細胞可達到近融合狀態，待顯微鏡下觀察細胞鋪滿瓶底約90%時，用胰蛋白酶消化，傳代培養。一般選取第三代狀態良好的細胞用于實驗。

1.4 細胞形態學觀察：培養的1代和3代細胞擴增后，在倒置顯微鏡觀察三組細胞的細胞形態變化和細胞外基質形成情況。

1.5 MTT法繪制細胞生長曲線：制備三組細胞懸液，A、B組取第一代細胞、C組取第三代細胞按細胞數2×106/L接種于96孔培養板中，隔日換液，每日測3孔取平均值，連測10天。吸出檢測孔培養液，加入5g/L的MTT液20μl/孔，孵育4h，棄去上清液后，加入DMSO 200μl/孔，震蕩10min后在酶聯檢測儀上測吸光度值，波長為490 nm。取細胞數的平均值作為結果，繪制生長曲線。

1.6 Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：取生長良好的第三代細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后以1×107/L濃度接種于預置有蓋玻片的六孔板中培養。培養3天后，將蓋玻片取出放入50g/L多聚甲醛溶液中，固定30min，PBS緩沖液清洗3次，室溫下用體種分數10%山羊血清封閉30min以阻斷非特異性結合，分別加入鼠抗兔Ⅰ、Ⅱ型膠原單克隆抗體（1:100），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液徹底清洗后，加入生物素標記二抗工作液孵育1h，DAB顯色，封固，顯微鏡觀察，以不加一抗為陰性對照。

1.7 阿新利藍檢測糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）：分別取每組原代和第三代生長良好的細胞，定量接種6×106個細胞于培養皿中，每周傳代一次，留取所有培養液進行檢測。吸1ml培養液，加入1.5%阿新利藍溶液1.5ml，室溫放置10min，以硫酸軟骨素為標準品，紫外分光光度計比色，根據標準曲線求得樣本GAG含量。

1.8 統計學分析：采用SPSS13.0統計軟件進行分析，實驗數據以x±s表示，兩組間均數采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，計算總體差異及進行兩兩比較。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態：每天相差顯微鏡下觀察，消化出的細胞多為圓形，接種24h后大部分細胞貼壁。細胞貼壁延展后體積增大，逐漸向外伸出偽足，形態多樣，大多數為圓形還有少量多角形細胞， 2～3天時長滿培養瓶底部逐漸融合成單層。當傳至第三代時，細胞逐漸向梭形轉變。原代細胞連續培養時可見細胞界限不清，逐漸聚集成團（圖1）。如果不傳代繼續培養1周時，細胞間開始有突起相連，周圍有基質樣沉積物質。以上形態學變化A、B兩組間無顯著區別。

2.2 BMSCs的形態：原代細胞接種后，培養物中未貼壁細胞隨著換液逐漸被去除，12h后可見有少量細胞貼壁，剛貼壁的細胞多為不規則形或短梭形，之后可見貼壁細胞逐漸增殖，形態也逐漸變為紡錘形或長梭形，1周左右即可傳代，傳代后細胞生長加快，第三代細胞純度較高，呈漩渦狀生長，狀態良好（圖2）。平均體外培養擴增10代左右，細胞的傳代周期約5～7天，10代后，細胞生長速度減緩，三角形和多角形細胞逐漸增多，呈老化狀態。

2.3 細胞增殖率：MTT法測定OD值繪制細胞的生長曲線，結果顯示細胞的增殖均呈現 “S”形，第1～4天細胞處于生長潛伏期，第5～8天細胞呈對數生長，大約在第9天達到平臺期。三組比較無統計學差異（P＞0.05）。

2.4 Ⅰ、Ⅱ型膠原組織化學染色：各組細胞免疫組化結果顯示，A、B組Ⅱ型膠原胞漿及基質陽性（圖3、4），Ⅰ型膠原陰性（圖5）；C組顯示Ⅰ型膠原胞漿陽性（圖6），Ⅱ型膠原陰性。

2.5 GAG 含量：各組細胞GAG含量由阿利新藍法測定，A組（0.3990±0.0067），B組（0.3609±0.0042），C組（0.0907±0.0057）。經統計學分析，A、B組間無顯著性差異（P＞0.05），A、B組與C組之間差異有顯著性（P＜0.05）。

3 討論

目前軟骨細胞移植成為治療軟骨大面積缺損的主要治療方法[3-4]。成年動物關節內可用于分離培養的軟骨細胞總量較幼年動物少，而且成年動物的關節軟骨組織容易存在損傷，所以本實驗選用3周齡的新西蘭大白兔獲取軟骨細胞。關節軟骨由軟骨細胞和細胞外基質組成，建立良好的機械和化學方法，通過原代培養和傳代培養，可分離出較高純度的軟骨細胞。機械分離時，需注意去除干凈軟骨表面的滑膜組織，盡可能把軟骨切細碎。軟骨細胞的化學解離主要采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶兩步消化法。胰蛋白酶的主要作用是水解細胞間質的蛋白質，Ⅱ型膠原酶的主要作用是分解細胞間Ⅱ型膠原產生的應力，同時結合機械吹打，可以使細胞脫落，也可以使酶和組織塊充分地接觸，有助于酶對組織塊的充分消化。原代細胞貼壁較慢，一般需要24h，其分裂增殖速度較慢，而傳代后貼壁和增殖的速度都大為增加，這可能與原代細胞在消化分離時受到一定的機械和化學損害有關。

軟骨細胞具有高分化特性，普通單層貼壁培養的軟骨細胞在體外難以維持表型，軟骨細胞會發生包括形態、表型和相關基因表達的一系列變化，細胞向成纖維細胞轉化，從而表達Ⅰ型和Ⅲ型膠原，喪失表達Ⅱ型膠原和分泌軟骨基質的能力[5-6]。在本實驗中還發現，三代以內培養的軟骨細胞相對穩定，以圓形、類上皮細胞樣外形為主，細胞分泌基質形成群體后，變成梭形或多角形，細胞活性高，保持細胞表型，是實驗研究的理想細胞。三代以后的細胞逐漸發生去分化，細胞體積增大，出現許多指狀突起，胞核增大，細胞增殖速度明顯減緩，分泌基質能力下降。在低密度情況下，關節軟骨易與基質間失去聯系，細胞因子無法提供反饋調節，細胞出現去分化，形態結構發生變化，合成Ⅱ型膠原的能力下降，轉化為成纖維細胞樣的細胞。高密度培養條件下，五代以內關節軟骨細胞均能高表達Ⅱ型膠原和GAG，大多數細胞亦能保持其正常形態，有助于自分泌細胞因子維持其表型和新陳代謝，阻止或減緩細胞的分化。所以在體外培養軟骨細胞時，應注意細胞的接種密度。

本實驗對兔關節軟骨與耳軟骨細胞在培養過程中所進行的一系列觀察與檢測，都沒有明顯差別，可以認為，兔耳軟骨細胞在功能上與關節軟骨細胞接近，可以作為關節軟骨的替代細胞，這樣就可以從原代細胞開始就可以獲得更大數量的軟骨細胞滿足實驗需要，同時又避免了對健康關節的損傷。

BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞，在不同的誘導條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、肌腱、脂肪細胞及骨髓基質等多種組織細胞。BMSCs雖具有較強的增殖能力，但在骨髓中的含量很低，因此，如何從貼壁的細胞群中分離純化BMSCs有著非常重要的意義。目前常用于分離BMSCs的方法有4種：全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法和流式細胞分離法[7]，其中以全骨髓貼壁法和密度梯度離心法最為常用。全骨髓貼壁法操作相對簡單，抽取骨髓沖洗后直接接種培養瓶，是根據BMSCs與造血系細胞貼壁性能不同而進行的體外分離純化方法[8]。BMSCs貼壁快，生長迅速，培養一段時間后，造血系細胞由于不貼壁而死亡或被換液去除。需要注意的是，細胞原代培養時要求無菌操作，在對骨髓腔沖洗時應注意推注壓力不宜過高，速度不宜過快，防止沖洗過程中造成細胞因機械應力損傷。密度梯度離心法是利用BMSCs與其他細胞的密度不同，用特定密度的淋巴細胞分離液把BMSCs分離出來，此方法可去除大量的血細胞以及其他骨髓間質細胞，細胞均一性好，便于早期觀察和定性細胞研究。全骨髓法細胞貼壁時間較密度梯度離心法早兩三天，可能是全骨髓法保留了骨髓環境中豐富的粘附分子和各種生長因子，而且大量不貼壁的血細胞并不影響BMSCs的貼附與增殖，同時血液成分的存在為BMSCs提供了一個穩定的培養環境和營養物質，有利于BMSCs的貼附與增殖[9]。因此，本實驗采用了貼壁篩選分離方法，可以最大程度地獲取純化BMSCs。

原代培養的BMSCs一般在24～48h內貼壁，通過換液及PBS沖洗去除懸浮生長的造血系細胞，傳代時利用BMSCs較易脫落，其他細胞貼壁性較強的特點，采用消化時間控制純化BMSCs。原代細胞首次融合時間需要7～10天，本實驗所獲的BMSCs貼壁能力較強，細胞呈均一的成纖維細胞形態，為梭形、三角形。目前研究沒有找到BMSCs的特異性標記物，BMSCs能夠表達CD44、CD68、CD77和CD90，而不表達CD34、CD45等造血細胞的特異性標志物。從本實驗所培養的細胞形態看，采用全骨髓貼壁法培養純化的細胞在十代內生長狀態穩定，梭形貼壁生長，呈均一的成纖維細胞形態，在對數生長期群體倍增時間約為48h，傳代周期約為5～7天。所獲得的BMSCs能穩定傳代十代以上，說明采用本方法獲得的細胞經多次傳代后能夠純化，適應能力強，增殖速度快，可以滿足一般的實驗要求。在體外培養擴增得到大量細胞同時，可見少量BMSCs自動分化。隨著細胞傳代超過十次以上，BMSCs出現衰老表現。因此，如何保持BMSCs的體外長期增殖和未分化狀態仍是干細胞研究的重點和難點。

軟骨細胞及BMSCs在體內的增殖和分化受多種因素影響，各因素之間相互形成一個復雜的網絡，完全模擬體內作用機制在體外培養細胞，短時間內還難以實現。本實驗通過對軟骨細胞及BMSCs的獲取和傳代培養，可以獲得大量的目的細胞，這兩種細胞作為組織工程骨-軟骨復合組織的種子細胞是可行的，為今后進一步進行誘導分化、組織構建及后續的體內移植實驗奠定了實驗基礎。

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[收稿日期]2011-12-10 [修回日期]2012-03-09

編輯/張惠娟