黑木耳多糖對ICR小鼠皮膚光老化的保護作用

[摘要]目的：探討黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharide，AAP）對ICR小鼠皮膚光老化的保護作用。方法：選取健康雌性ICR小鼠共50只，隨機分成5組各10只：正常組(A)、模型對照組(B)、模型+AAP低劑量（50 mg/kg.d）灌胃組(C)、模型+AAP中劑量（100 mg/kg.d）灌胃組(D)、模型+AAP高劑量（200 mg/kg.d）灌胃組(E)。長波紫外線（ultraviolet A， UVA）聯合中波紫外線（ultraviolet B，UVB）照射小鼠制備皮膚光老化模型。每周一、三、五照射，第1周每次照射時間1h，以后每周依次增加1h，自第5周起為5h，直至第14周照光結束。每次照光前各治療組小鼠給予不同濃度的AAP灌胃。實驗結束后取小鼠背部皮膚用測試盒測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase， GSH-PX）活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；組織切片HE染色觀察皮膚結構改變。結果：與正常組比較，模型對照組皮膚組織中SOD、GSH-PX活力顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著增高（P<0.05）；與模型組對照組比較，AAP各灌胃組SOD、GSH-PX活力顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。模型對照組皮膚出現皮屑、褐黃、粗糙肥厚、深皺紋、缺乏彈性等光老化特征，組織切片呈現光老化改變。AAP各治療組皮膚外觀及組織學特點均較模型對照組明顯改善。結論：AAP能有效提高小鼠抗氧化能力，對小鼠皮膚光老化有保護作用。

[關鍵詞]光老化；黑木耳多糖；ICR小鼠

[中圖分類號]R332 R758 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）05-0759-03

Protective effects of Auricularia auricular polysaccharide on skin photoaging in ICR mice

YI Qing-ling，ZENG Wei-hui，LIU Yan-ting，XU-lei

(Department of Dermatology of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004，Shanxi，China;2.Department of Dermatology of The Second Hospital of Chengdu)

Abstract: Objective To study the protective effects of Auricularia auricular polysaccharide (AAP）on photoaged ICR mice skin. Methods Fifty healthy female ICR mice were divided into five groups (n = 10) randomly: normal group(A)，model control group(B)，at dose of 50 mg/kg.d group(C)， at dose of 100 mg/kg.d group(D)， at dose of 200 mg/kg.d group(E). To establish skin photoaging mice models by irradiated UVA and UVB three times weekly (Monday，Wednesday and Friday).In the first week the time of UV exposure was 1 hour each time， then increased by 1 hour per week until week 5， and maintained the time until the 14th week. Before every UV irradiation， the AAP were orally administered with different dose to treated mice groups respectively. At the end of the experiment，the superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) activities， malondialdehyde (MDA) content in the skin were detected by assay kit.The skin tissue was observed by HE staining histological sections. Results Compared with the normal group， the activities of SOD and GSH-PX were decreased significantly (P<0.05)，and the content of the MDA was increased significantly (P<0.05) in the model control group. Compared with the model control group， the activities of SOD and GSH-PX in group C， D and E were increased significantly (P<0.05)，and the content of MDA was reduced significantly(P<0.05) in every AAP treatment group．The model control group appeared photoaging features， such as scale，brown-yellow color，coarse，thickened，deep wrinkles and poor flexibility. While compared with the model control group，both the skin appearance and histological change of AAP treatment groups were improved significantly. Conclusion AAP has protective effect on the skin photoaging in ICR mice via increasing the capacity of anti-oxidation．

Key words：photoaging；Auricularia auricular polysaccharide; ICR mice

皮膚光老化是皮膚外源性老化的一個重要組成，是由自然光或人工紫外線（ultraviolet ，UV）光源反復照射引起的皮膚損傷[1]。日光中的長波紫外線（UVA）及中波紫外線（UVB）與光老化的發生密切相關。其發生機制之一是紫外線引起皮膚組織產生大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫和單線態氧[2]， 使機體發生氧化應激，造成細胞和組織的損傷。SOD、GSH-PX是機體重要的抗氧化酶，MDA是機體細胞膜受自由基攻擊后產生的脂質過氧化產物，三者的測定相互配合能間接反映機體細胞受氧化損傷的程度。研究發現黑木耳多糖具有調節機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗凝血、抗突變、防輻射等生物活性[3]，有清除超氧陰離子、抗氧化及保護線粒體的功能[4]。本研究采用UVA聯合UVB照射ICR小鼠建立光老化模型，探討黑木耳多糖灌胃治療對小鼠皮膚光老化是否具有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料：雌性斷乳ICR小鼠，體重18～22g，由西安交通大學實驗動物中心提供；40W紫外線燈管UVB4支、UVA2支，購于合肥賽帆試驗設備有限公司； SOD、GSH-PX、MDA測試盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；黑木耳多糖（純度60%）購于西安斯諾特生物技術有限公司，常溫干燥保存；可見光分光光度計、離心機、恒溫水浴箱等。

1.2 造模:40W紫外燈管（UVB4支，UVA2支）并列裝于木箱制成燈箱[5]，將除正常組以外的各組小鼠分籠放入燈箱中照射，小鼠背部距燈源30cm。每次照射前燈管預熱15分鐘。首次照光前一天用電推剪和市售脫毛膏給小鼠背部脫毛，脫毛面積約9cm2，以后每周脫毛1～2次。每周照射3次（周一、三、五），第1周每次照射1h，以后每周每次增加1h，自第5周起每次5h，直至第14周照光結束。

1.3 動物分組及處理:ICR小鼠50只隨機平均分成5組：正常組(A)、模型對照組(B)、模型+AAP低劑量（50mg/kg·d）灌胃組(C)、模型+AAP中劑量（100mg/kg.d）灌胃組(D)、模型+AAP高劑量（200mg/kg.d）灌胃組(E)。將黑木耳多糖溶解在生理鹽水中配制成灌胃液。正常組及模型對照組灌胃相應體積的生理鹽水。各組均在每次照光前稱體重、灌胃。

1.4 取材：最后一次照光結束24h后用6%硫化鈉溶液給小鼠背部脫毛。脫毛24h后腹腔注射水合氯醛處死小鼠，立即取下背部脫毛處全層皮膚。一部分放入10%福爾馬林溶液中固定過夜，制作病理組織切片，HE染色。一部分皮膚去除皮下脂肪，在冰凍的生理鹽水中漂洗，冷凍于-70℃冰箱以制備組織勻漿。

1.5 10%皮膚組織勻漿的制備：將皮膚用濾紙拭干，稱重放入小燒杯中，加人冷生理鹽水(生理鹽水的總量是皮膚組織塊重量的9倍)，盡快剪碎后移入玻璃勻漿器制成勻漿[6]用于測定GSH-PX、SOD活力及MDA含量。

1.6 指標測定：SOD活力的測定采用黃嘌呤氧化酶法；GSH-PX是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異的催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應，其活力以催化GSH的反應速度來表示； MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。各項指標的具體測定步驟按測試盒說明書。組織蛋白含量用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒測定。每項指標的吸光度用可見分光光度計測定。

1.7 統計學處理：所有數據均用SPSS13.0統計分析軟件處理，數據用 表示，各組均數間的差異用方差分析進行檢驗，并用LSD-t檢驗作兩兩比較。

2 實驗結果

2.1 SOD、GSH-PX活力及MDA含量：與正常組比較，模型對照組皮膚組織中SOD、GSH-PX活力顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著增高（P<0.05），表明長期紫外線照射可明顯抑制抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，增加脂質過氧化產物MDA的含量；與模型組比較，AAP各灌胃組SOD、GSH-PX活力顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。AAP低、中、高治療組間各指標均存在顯著性差異（P<0.05），且隨AAP劑量的增加，SOD、GSH-PX活力增高，MDA含量降低。說明AAP能有效保持或提高光老化小鼠皮膚組織中的SOD、GSH-PX活力，降低MDA含量（見表1）。

2.2 肉眼觀察：正常組小鼠背部皮膚光滑、薄嫩、紅潤、有彈性；隨著照光劑量的增加模型對照組小鼠皮膚逐漸出現皮屑、褐黃、粗糙肥厚、深皺紋、缺乏彈性等光老化特征。AAP灌胃組皮膚外觀接近正常組（圖1）。

2.3 組織切片HE染色結果：利用圖像分析系統(×20)觀察，正常組表皮連續，結構完整、較薄、分層清晰，真皮層可見均勻分布的長條形膠原纖維束，方向與皮面平行（圖2A）；模型對照組：表皮增厚，角化過度伴角化不全，真皮層明顯變厚，纖維排列紊亂，分布不均，出現變粗、卷曲、斷裂，說明光老化模型建立成功（圖2B）。AAP治療組表皮厚度接近正常，真皮纖維束排列較整齊均勻，少見斷裂、卷曲等，較模型對照組有明顯改善，尤其高劑量組更接近正常組表現（圖2C～E）。

3 討論

本課題通過UVA聯合UVB照射ICR小鼠成功建立了小鼠皮膚光老化模型。結果顯示長期紫外線照射使小鼠皮膚出現粗深皺紋、粗糙增厚、缺乏彈性、斑駁狀色素沉著或顏色褐黃無光澤、皮屑或痂殼等典型光老化特征，組織切片上表現為真皮、表皮均明顯增厚，表皮角化過度伴角化不全，真皮纖維變性，排列紊亂；皮膚組織中的抗氧化酶SOD、GSH-PX活力降低，脂質過氧化產物MDA含量升高。

大量研究證實，紫外線對皮膚的損傷與活性氧簇（ROS）的產生密切相關。ROS激活細胞表面相關受體，啟動相關信號傳導，導致基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）合成增多，同時抑制膠原蛋白的合成，MMPs可降解皮膚中的膠原纖維，引起皮膚光老化的典型組織病理改變[7]。人體的抗氧化防御系統包括：非酶抗氧化劑，如谷胱甘肽（glutathione， GSH）；酶抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等[8]。ROS能消耗和破壞皮膚的非酶和酶抗氧化防御系統[9]，當產生的ROS超過了細胞的清除能力時，使機體發生氧化應激，造成細胞和組織的損傷。SOD能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。GSH-PX是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異的催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。MDA是機體細胞膜受自由基攻擊后產生的脂質過氧化物，而且能進一步放大活性氧的作用，其含量的高低間接反應出細胞氧化損傷的程度。

已有研究發現黑木耳多糖（AAP）能升高自然老化小鼠模型血漿、心臟、肝臟中的SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量[10]；能減少大鼠慢性腦缺血損傷，使腦組織中的SOD活性顯著升高，MDA生成減少[11]；能提高高強度微波輻射大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量[12]。李興泰等人的研究發現AAP有清除超氧陰離子、抗氧化及保護線粒體的功能。本研究將AAP用于小鼠皮膚光老化的防治，結果提示黑木耳多糖能有效抵御紫外線對皮膚的老化損傷，減少皺紋、色素沉著等的發生，顯著提高皮膚組織中SOD、GSH-PX活力，同時降低MDA含量。表明AAP對提高皮膚的抗氧化能力有積極的作用。其機制可能是一方面AAP本身具有清除自由基的作用；另一方面黑木耳多糖可以通過提高SOD、GSH-PX活力來達到增強抗氧化能力的目的。但具體機制尚待進一步的研究。

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[收稿日期]2011-12-13 [修回日期]2012-03-12

編輯/張惠娟