中波紫外線對(duì)人血小板線粒體DNA影響的初步觀察

[摘要]目的：觀察中波紫外線對(duì)人血小板線粒體活性及線粒體DNA的影響，探討其作為評(píng)測(cè)光損傷敏感系統(tǒng)的可行性。方法：以不同能量的中波紫外線照射人血小板，觀察血小板線粒體活性及線粒體DNA光化產(chǎn)物環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）含量的變化。結(jié)果：接受不同能量中波紫外線照射的血小板，線粒體活性明顯降低（P<0.05），環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）含量則明顯增加（P<0.05）。結(jié)論：人血小板線粒體活性與環(huán)丁烷嘧啶二聚體含量對(duì)中波紫外線的照射敏感，并與其劑量呈依賴關(guān)系，可很好反映中波紫外線對(duì)生物體光損傷作用。

[關(guān)鍵詞]中波紫外線；人；血小板；線粒體DNA；環(huán)丁烷嘧啶二聚體

[中圖分類號(hào)]Q591.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）05-0756-03

The efficacy of ultroviolet B irradiation to mitochondria DNA of human platelets

HUANG Mao-fang1，3，LIU Zhong-rong2，YANG Hui-lan2，ZHANG Ling1，2，XUE Li-zhang2，ZHANG Fa-zhou2

(1.Graduate Institute of Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China;2.Department of Dermatology，the General Hospital of Guangzhou Military Command;3.Guangzhou Dermatitis Preventive Institute）

Abstract: Objective To investigate whether human platelets could be applied on photoaging research. Methods After human platelets were irradiated with different doses of ultroviolet B， changes of mitochondria activity and cyclobutane pyrimidine dimmers（CPDs）in mitochondria DNA were observed. Results Change of mitochondria activity had significant difference(P<0.05)， and content of CPDs in mitochondria DNA increased with doses of UVB. differences were statistical significance (P<0.05). Conclusion Preliminary study deduce that mitochondria activity and content of CPDs in mitochondria DNA were sensitive to different doses of UVB， and human platelets can be applied on photic injury research.

Key words:ultroviolet B;human; platelet; Mitochondria DNA; activity;cyclobutane pyrimidine dimmers

血小板是巨核細(xì)胞的衍生物，成熟的血小板內(nèi)無(wú)細(xì)胞核而含有線粒體及線粒體DNA（mtDNA）[1]。線粒體內(nèi)缺乏DNA損傷修復(fù)的酶系統(tǒng)，并且進(jìn)行復(fù)制時(shí)所需要的DNA聚合酶是由核DNA編碼的，因此一旦沒(méi)有細(xì)胞核的血小板的mtDNA受損，損傷所致的mtDNA損傷可以很好的保留下來(lái)[2]。根據(jù)這一特點(diǎn)，我們認(rèn)為mtDNA很可能可以作為體外評(píng)價(jià)紫外線光損傷作用的敏感系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)以人血小板為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)中波紫外線照射下血小板線粒體活性及線粒體DNA出現(xiàn)了變化。

1 材料和方法

1.1 材料：新鮮血小板由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院輸血科提供，來(lái)源于經(jīng)常規(guī)檢測(cè)為正常的健康志愿者獻(xiàn)血的機(jī)采樣本9份。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：動(dòng)物線粒體提取試劑盒（GENMED公司），Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針（碧云天生物技術(shù)研究所），5% 牛血清蛋白（Sigma），環(huán)丁烷嘧啶二聚體單克隆抗體（sigma公司），兔抗小鼠－HRP標(biāo)記抗體（SouthernBiotech）。日光模擬器（上海希格瑪高科技有限公司，UV-100），超級(jí)酶標(biāo)儀（Bio Rad，MXLEL 680），熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：收集新鮮血小板30～40ml。以PBS溶液稀釋新鮮血小板至5×1011/L，分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組按2ml/孔置于24孔板，以日光模擬器發(fā)射的UVB作為光源照射1min，對(duì)照組不經(jīng)照射處理。本實(shí)驗(yàn)觀察在不同能量作用下，照射前后血小板線粒體活性及線粒體DNA的變化。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 中波紫外線照射劑量：以當(dāng)日所測(cè)的UVB能量進(jìn)行照射，實(shí)驗(yàn)使用的中波紫外線能量見表1。照射時(shí)間為1min。

1.4.2 血小板線粒體活性的測(cè)定[3]：用動(dòng)物血小板線粒體粗提分離試劑盒，參照說(shuō)明書上的方法進(jìn)行血小板線粒體分離與提取。按Mito-Tracker Green綠色熒光探針說(shuō)明書步驟進(jìn)行線粒體活性檢測(cè)：以無(wú)水DMSO74.4μl溶解Mito-Tracker Green至終濃度為1mM。然后用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（1640）稀釋7000倍（即10ml 培養(yǎng)基加入1.5μl Mito-Tracker Green作為染色工作液，37℃避光預(yù)溫。向提取出的血小板線粒體加入200μl的工作液。37℃孵育20min。去除Mito-Tracker Green染色工作液，等體積加入預(yù)溫的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡觀察，其中激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為516nm，反復(fù)測(cè)3次，讀取數(shù)據(jù)。

1.4.3 血小板線粒體DNA環(huán)丁烷嘧啶二聚體的測(cè)定[4]：照射后1h以動(dòng)物血小板線粒體粗提分離試劑盒提取血小板線粒體DNA，在OD 260nm 檢測(cè)分光光度吸收值測(cè)血小板線粒體DNA樣品的濃度，將樣品置沸水浴10min使其變性，然后冰浴快速冷卻，用PBS溶液稀釋到終濃度為2μg/ml。取溶液50μl加入到96孔聚苯乙烯板，干燥后以ELISA方法在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD490nm的數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)之間的差別比較用單因素方差分析，比較數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性采用spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板線粒體功能的測(cè)定結(jié)果：線粒體染色的熒光值見表2，對(duì)應(yīng)的熒光值均數(shù)圖見圖1。

其中，樣本A-H表示對(duì)應(yīng)表1照射的光孔順序，樣本0為對(duì)照組。對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析顯示，F(xiàn)=4455，P<0.05，表示UVB照射前后血小板線粒體熒光值的均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用SNK法進(jìn)行方差分析，均顯示P<0.05。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行spearman相關(guān)性分析顯示，r=0.994，P<0.01。從圖1可見，隨UVB照射的能量增加，實(shí)驗(yàn)組線粒體活性出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的改變，線粒體活性逐漸降低。

2.2 血小板線粒體DNA環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）的測(cè)定結(jié)果 線粒體DNA在490nm的OD值見表3，對(duì)應(yīng)的OD值均數(shù)圖見圖2。

其中，樣本A-H表示對(duì)應(yīng)表1照射的光孔順序，樣本0為對(duì)照組。對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析顯示，F(xiàn)=345.5，P<0.05，表示UVB照射前后血小板線粒體CPDs OD值的均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行spearman相關(guān)性分析顯示，r=0.389，P<0.01，表示CPDs的含量變化與UVB照射劑量有關(guān)。從圖2可見，隨UVB照射的能量增加，實(shí)驗(yàn)組線粒體DNA光損傷產(chǎn)物CPDs的含量逐漸增加。用SNK法對(duì)OD值的均數(shù)進(jìn)行兩兩比較，顯示C組與D組P>0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；F組與G組P>0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其余各組之間P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖2可見，雖然UVB照射的劑量以1.41倍不斷遞增，但血小板線粒體光損傷產(chǎn)物CPDs的含量并非直線上升，在C組到D組，以及F組到G組時(shí)可出現(xiàn)兩個(gè)平臺(tái)期。

3 討論

皮膚光老化是在日光照射條件下長(zhǎng)期作用的結(jié)果。雖然紫外線照射可直接損傷皮膚組織細(xì)胞的DNA，但細(xì)胞核DNA有酶修復(fù)系統(tǒng)，一過(guò)性的輕微損傷可能經(jīng)過(guò)修復(fù)而無(wú)法檢測(cè)，因此，光老化的研究中，尋找能保留光損傷的敏感載體非常有必要。

線粒體是人體細(xì)胞中除細(xì)胞核外唯一具有自身遺傳物質(zhì)（如DNA）的細(xì)胞器。其主要功能是通過(guò)呼吸鏈(電子傳遞鏈和氧化磷酸化系統(tǒng))為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，并參與一些重要的代謝通路[5]。線粒體DNA的特點(diǎn)是缺乏組蛋白的保護(hù)并且沒(méi)有完整的突變修復(fù)功能，因此mtDNA的突變率遠(yuǎn)高于核DNA突變[6]，這些特點(diǎn)使線粒體對(duì)損傷的反應(yīng)非常敏感，線粒體DNA突變及累積被認(rèn)為是人類皮膚老化尤其是皮膚光老化的重要因素[2]。而研究線粒體DNA的變化需要排除核DNA的影響，這是我們選擇用不含核DNA的血小板作為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象的原因。

光老化線粒體的損傷可表現(xiàn)為線粒體膜電位的降低，過(guò)氧化產(chǎn)物的增加，ATP合成的減少等[7]。從整體上而言，都是線粒體活性降低的表現(xiàn)之一。我們以對(duì)皮膚的損傷強(qiáng)度比UVA大約800～1000倍的中波紫外線（UVB）[8]照射血小板，從整體上觀察照射前后血小板線粒體活性，以及mtDNA光損傷產(chǎn)物CPDs的變化，作為研究體外評(píng)價(jià)紫外線光損傷作用的參考指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)中所用的Mito-Tracker Green綠色熒光探針，可特異性被線粒體以不依賴膜電位的形式攝取，線粒體活性好，則攝取的探針多，則顯現(xiàn)的熒光亮且均勻。通過(guò)觀察線粒體攝取能力的變化，可作為評(píng)價(jià)線粒體活性的一個(gè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以不同能量的UVB照射血小板達(dá)1min，線粒體活性出現(xiàn)了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變化，而且UVB照射的劑量不同，熒光值也隨之波動(dòng)：UVB能量越大，線粒體攝取的探針越少，熒光值則越低。這說(shuō)明，UVB照射能影響血小板線粒體的活性，而且這個(gè)改變比較靈敏，隨照射劑量的不同而改變，有利于實(shí)驗(yàn)室條件下光損傷的研究。

UVB照射皮膚細(xì)胞可直接引起DNA損傷，核酸DNA的芳香族雜環(huán)堿基對(duì)是UVB的強(qiáng)吸收色基。在UVB照射下，同條DNA鏈上相鄰的嘧啶堿基形成聚和體，即光產(chǎn)物，包括環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）、6-4光產(chǎn)物（6-4PPs）及其異構(gòu)體。有核細(xì)胞DNA在損傷后可進(jìn)行自我修復(fù)，約90% 6-4PP在照射后3h即被修復(fù)[9]，而CPDs的堿基易突變，形成量大(占70%～80%)，是6-4PPs的3倍，故常認(rèn)為CPDs是細(xì)胞光損傷的主要產(chǎn)物[10]。在血小板線粒體中，DNA沒(méi)有酶修復(fù)系統(tǒng)，這些光損傷比表皮細(xì)胞更容易保留。我們觀察到不同劑量的UVB照射下，血小板線粒體DNA光損傷產(chǎn)物CPDs的含量隨之變化，同時(shí)還有與劑量相關(guān)的平臺(tái)期，說(shuō)明UVB照射能直接損傷血小板線粒體DNA，而且這個(gè)改變?nèi)菀妆Ａ粝聛?lái)被檢測(cè)到，并且這個(gè)改變與照射劑量的有相關(guān)性，有利于實(shí)驗(yàn)室條件下從DNA角度對(duì)光老化進(jìn)行研究。

在不同劑量的UVB照射下，我們觀察到血小板不僅有線粒體活性的損傷，同時(shí)合并有線粒體DNA光損傷產(chǎn)物的變化，而且，這些變化程度都與照射的劑量有相關(guān)性，隨著照射劑量的增加，線粒體DNA的損傷在不斷加重，活性不斷降低。這表明，把血小板作為作為體外評(píng)價(jià)紫外線光損傷作用的敏感系統(tǒng)是可行的。如果能建立體外評(píng)價(jià)光損傷的細(xì)胞系統(tǒng)，將有利于體外進(jìn)行光損傷相關(guān)機(jī)制的研究及抗光損傷藥物的篩選等。

[參考文獻(xiàn)]

[1]鮑幼玲，黃耀熊，蔣鴻雁，等.微波輻射對(duì)血小板線粒體基因的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志， 2007，24(2):137-139.

[2]劉仲榮，劉榮卿，張國(guó)威，等.PUVA誘導(dǎo)皮膚mtDNA4977bp缺失突變累積的研究[J].臨床皮膚科雜志，2002，31(12):743-745.

[3]黃茂芳，劉仲榮，楊慧蘭，等.中波紫外線對(duì)人血小板線粒體活性影響的初步觀察[J].皮膚性病診療學(xué)雜志，2011，18(2):73-75.

[4]林向飛，駱 丹，閔 瑋，等. UVB 輻射后HaCaT 細(xì)胞光產(chǎn)物的產(chǎn)生和清除及 EGCG 的干預(yù)作用[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2006，15(4):384-386.

[5]DiMauro S， Schon EA. Mitochondrial respiratory-chain diseases[J].N Engl J Med， 2003， 348: 2656?2668.

[6]王學(xué)波，李建遠(yuǎn).人線粒體DNA熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究，2008，27(4):298-301.

[7]黃發(fā)軍，曾凡慧. 衰老過(guò)程中線粒體的改變[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，26（2）：80-83.

[8]Nghiem DX， Kazimi G.Clydesdale，et al. Ultraviolet A radiation suppresses an established immune response: Implications for sunscreen design[J].J Invest Dermatol，2001，117:1193-1199.

[9]Xu G，Snellman E，Jansen CT，Hemminki K. Levels and repair of cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 photoproducts in skin of sporadic basal cell carcinoma patients [J]. J Invest Dermatol，2000，115(1):95-99.

[10]You YH，Lee DH，Yoon JH，et al. Cyelobutane Pyrimidine dimmers are responsible for the vast majority of mutations induced by UVB irradiation in mammalian cells[J].Biol Chem，2001，276:44688-44694.

[收稿日期]2012-01-10 [修回日期]2012-03-09

編輯/張惠娟