脂肪干細胞在組織修復中對血管化影響的研究進展

在創面愈合、組織移植的過程中，如何能構建新生血管，建立新的血液循環，起著至關重要的作用。因此，學者們進行了大量的研究，試圖了解并尋求在血管化建立的過程中，發揮作用的各個環節及影響因素，通過控制這些因素提高組織的血管化進程及再生修復能力。近年來的研究顯示間充質干細胞（Menchymal stem cells，MSCs）對血管化具有明顯的促進作用。MSCs最早是由Friedenstein[1]在骨髓中發現的，此后研究發現MSCs可以廣泛分布于體內其他組織中，包括脂肪、肌肉、肝臟、胰腺、腎臟和臍血等處，其中脂肪來源的MSCs（Adipose-derived stem cells，ADSCs，ADSCs)因其來源廣泛、取材方便等優勢逐漸受到重視，ADSCs對血管化的影響更是很多專家學者研究和致力的方向。本將就近年來ADSCs對血管化促進作用的研究狀況進行綜述。

1 脂肪干細胞的生物學特性

ADSCs是從脂肪組織中分離出來的具有多向分化潛能的成體干細胞。2001年，Zuk等[2]首次從人吸脂術抽取的脂肪組織懸液中分離提取到ADSCs，此后人們對ADSCs的研究就一直在不斷深入。作為一種多能干細胞，ADSCs和骨髓間充質干細胞（Bone menchymal stem cells，BMSCs）在細胞生長增殖方式、多向分化潛能等方面都無顯著差異[3]，在體外可以誘導分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、內皮細胞、上皮細胞、神經細胞、肝細胞、胰島細胞、表皮細胞、真皮細胞和牙齒相關細胞等。在表型上，其陽性表達CD9，CD29，CD49，CD54，CD105，CD106，CD166，CD44，CD71，CD10，CD13.CD73，CD90，CD146，CD55，CD59，Ⅰ和Ⅲ型膠原，骨橋蛋白，α平滑肌肌動蛋白，Ⅰ型組織相容性抗原HLA-ABC，陰性表達的分子有CD11b，CD18，CD50，CD56，CD62，CD14，CD31，CD45，Ⅱ型組織相容性抗原HLA-DR[4]。與BMSCs相比，ADSCs具有以下優勢：①組織獲取方法簡單，來源充足，手術創傷小，可以反復取材；②脂肪組織中干細胞的含量非常豐富；③易在體外培養，且具有較強的體外增殖能力。隨著分離技術方法的逐步改進，目前ADSC的分離、培養已經逐步成熟，在獲得更多數量的同時，可以保證ADSC的活性功能及多向分化潛能。但由于尚未發現其特異性的表面標志，免疫組化和流式細胞儀檢測等免疫表型的結果對確認脂肪干細胞也只能起到輔助作用，目前鑒定脂肪干細胞的最好方法是進行多系定向誘導，并進行相應檢測以確定誘導的成功。

2 脂肪干細胞在組織修復中血管化的作用機制研究

創面愈合是經過炎癥反應，上皮形成，血管形成及擴增等一系列步驟完成的，而形成成熟且有功能的血管網絡則依賴于內皮細胞和平滑肌細胞的相互作用。目前已經證明，ADSCs在體內外均可以分化為血管內皮細胞、平滑肌細胞，同時還可以分泌多種促進血管化的細胞因子，協同機體內其他促血管新生細胞共同完成受損組織的修復過程。

2.1 脂肪干細胞向血管內皮細胞、平滑肌細胞的分化：ADSCs在一定條件下可以向血管內皮細胞、血管平滑肌細胞分化。Cao等[5]將ADSCs培養在含有血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic firbroblast growth factor，bFGF）的培養液中，發現有管樣結構形成，內皮細胞表型表達呈陽性，并具有典型的內皮細胞吞噬功能。這一結果可以證明ADSCs在適當的條件下可被誘導成內皮細胞，并參與脈管管腔的形成。Matsumoto等[6]將標記有Dil的ADSCs與脂肪顆粒混合移植于裸鼠的背部皮下，4周后在移植物新生血管周圍發現有標記Dil的血管內皮細胞生成。ADSCs這種向血管內皮細胞分化的能力被隨后的大量實驗不斷證實[7-8]。此外，還有人在體外培養環境下，應用轉化生長因子β1與血小板衍生生長因子-BB聯合誘導14天后，發現ADSCs呈現血管平滑肌細胞特有的峰谷樣生長，且表達血管平滑肌特異的表面抗原標記物，即α平滑肌激動蛋白、肌鈣蛋白、肌球蛋白重鏈和平滑肌-22α，說明ADSCs具有向血管平滑肌細胞分化的潛能[9]。Lu等[10]通過向小鼠背部皮瓣基底注射ADSCs術后7天，分析背部皮瓣血管密度和單位組織內血管內皮細胞數量發現，實驗組的血管密度和血管內皮細胞數量最大，認為ADSCs有促進血管重建功能。另有實驗發現，ADSCs對缺血患肢的效果要優于BMSCs，與BMSCs 和內皮前體細胞移植僅形成毛細血管不同，脂肪干細胞在移植后還形成類似于結構完整的較大的血管樣結構[11-12]。提示ADSCs在新血管形成方面具有更大的潛力和優勢。

2.2 脂肪干細胞的旁分泌功能：ADSCs能夠促進血運的恢復不僅是由于具有向血管內皮細胞、平滑肌細胞分化的潛能，旁分泌作用在其中也起到了重要作用。許多實驗證實，ADSCs 能通過自分泌或旁分泌的途徑來上調一些促血管生成細胞因子的表達，如VEGF、bFGF、血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor -β，TGF-β）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth facor，PDGF) 、胎 盤 生 長 因 子(placenta growth factor ，PlGF )等。在缺血等病理條件下，bFGF和VEGF在mRNA水平和蛋白水平表達會進一步增多[13-15]。

Zografou等[16]將分離、培養后的ADSCs用熒光染色標記后注射到行全厚皮膚移植的小鼠皮下，實驗結果顯示，實驗組移植物壞死的面積遠小于對照組（6.12%vs 32.62%，P＜0.01），實驗組移植區血管密度明顯增加，膠原增厚，VEGF和TGF的表達較對照組明顯升高。王杰華等[17]將SD大鼠制備成局灶性腦缺血模型（MCAO模型），將用DAIP標記后的ADSCs注入大鼠側腦室，經術后4天、7天、14天取腦組織，采用免疫組化和半定量RT-PCR法檢測缺血區腦組織的新生血管及bFGF、VEGF表達的動態變化。結果發現ADSCs組較對照組缺血區的微血管密度、腦組織中bFGF及VEGF的表達水平均明顯增高，且微血管生成的數量與bFGF、VEGF的表達趨勢一致，表明ADSCs可以促進缺血損傷腦組織中新生血管形成以及bFGF和VEGF表達的上調。

2.3 脂肪干細胞與其他促血管新生細胞的協同作用：ADSCs不僅能通過誘導向促血管新生的細胞分化，還可以與其他促血管生長的細胞協同作用，增強各自促血管新生的能力。將ADSCs與血管內皮細胞共同培養后注入受區，可見ADSCs聚集在毛細血管周圍，緊貼血管壁，同時血管伸出新芽，并且發現血管內皮細胞存活率大大提高，聯結成血管網絡的能力明顯增強[18]。ADSCs還可以通過表達縫隙連接蛋白Connexin43來調節內皮細胞與血管壁細胞之間的相互作用，以維持新生血管的穩定性。在這一過程中ADSCs所分泌的細胞因子如VEGF、PDGF-β、TGF-β-、Ang-1及其受體TIE也發揮了重要的作用[19]。同樣，血管內皮細胞也可以分泌多種細胞因子作用于ADSCs，如bFGF可以刺激ADSCs生長，PDGF通過c-Jun氨基端激酶蛋白激酶途徑誘導ADSCs增殖和遷移[20-21]。血管內皮細胞還可以與ADSCs相互作用調節細胞因子的分泌，促進兩種細胞分泌的細胞外基質積累，反過來誘導血管成熟[22]。ADSCs還可以與成纖維細胞協同（Fibroblast，FB）來促進創傷愈合。FB是創面修復中起重要作用的細胞，ADSCs可以促進FB在增殖的同時增強其遷徙能力，并且是通過其旁分泌VEGF、HGF、bFGF的功能來實現的[23]。Kim等[24]在研究中發現，ADSCs促創面愈合和抗氧化的作用可以通過刺激FB和角化細胞來發揮功能，被活化的兩種細胞以旁分泌的方式對周圍創傷組織的修復起到促進作用，從而加速創面的愈合。Kim等[25]還在實驗中發現ADSCs通過刺激FB，促進了皮下膠原的合成，在促血管新生的同時增加了皮膚的厚度、皮下膠原密度及成纖維細胞數量，將ADSCs帶入皮膚抗衰老的研究領域，拓寬了ADSCs在未來的應用范圍。

3 ADSCs作為基因轉染的靶細胞發揮促血管化作用

目前普遍認為VEGF主要作用于血管形成的早期，促進原始血管網的生成；Ang作用于隨后的血管改建和塑形階段，促進成熟、有空間結構的血管網形成；PDGF和TGF-β主要促進周細胞和平滑肌細胞的動員，促使新生毛細血管動脈化[26]。基于這種理論 ，Chen等[27]發現通過空間定位和時序性控制對VEGF、PDGF的釋放，可以獲得更成熟的血管。然而由于直接應用這些生長因子存在半衰期短、效應無法長時間發揮的弊端，所以近年來，生長因子的釋放技術成為又一項研究熱點。利用基因轉染技術將目標因子的基因介導至種子細胞內，使細胞持續合成并表達所需的生長因子，從而發揮生物學作用。而ADSCs作為組織工程中一種非常理想的種子細胞，應用基因轉染技術，將目的基因如VEGF、HGF等導入ADSCs，不僅可以對生長因子的釋放時機、濃度梯度進行人為控制，還可以利用ADSCs自身的趨化性、“歸巢”作用將目的基因攜帶至受損區域，充分發揮促血管新生及損傷修復的作用。因此，出現了大量利用細胞基因轉染技術轉染ADSCs來促進血管化的實驗研究。Lei等[28]證實ADSCs可作為載體細胞運送VEGF基因到皮瓣遠端并通過分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。吳一杰等[29]應用腺病毒介導HGF基因轉染ADSCs，作用到游離移植的脂肪組織中，促進了脂肪顆粒的血管化，增加了脂肪的成活率和質量。但是這種基因治療方法的穩定性、可控性及安全性尚需進一步研究。

4 影響ADSCs發揮作用的其他因素

ADSCs對組織的血管化、新生血管的重塑是通過多種機制進行的。不僅依賴細胞因子及細胞基質間的相互作用，還受其他因素調控。

4.1 ADSCs的歸巢作用：近年來隨著干細胞微環境（stem cell niche）的提出，如何創造一個適合干細胞生存的微環境，是應用細胞技術促進創面再生與修復的重要條件。ADSCs通過分泌和釋放一系列細胞因子，在一定程度上起到了改善微環境的作用，可能會更加利于干細胞生長、調節自我更新[30]。南華等[31]將Dil標記后的ADSCs通過SD大鼠尾靜脈注射來觀察ADSCs在動物體內的分布情況，在細胞移植后48天，獲取實驗組器官組織，用熒光顯微鏡觀察，發現肺、脾組織內滯留大量且發出較強熒光的細胞，肝、心、腎組織內亦可見較多細弱熒光顆粒分布，遠隔部位的正常皮膚組織及內臟脂肪中僅見少量熒光；對比正常皮膚軟組織與創傷愈合組織，后者積聚的標記細胞數量明顯多于前者，且標記細胞主要聚集于創傷區皮膚組織、皮下組織深層內，皮下組織淺層和肌層內僅少量熒光。喬曉俊等[32]將ADSCs經脊髓損傷的大鼠尾靜脈移植后，觀察ADSCs在受損傷脊髓組織的聚集情況，發現被標記的ADSCs能遷移到脊髓受損區，并隨時間的推移，細胞遷移有增加的趨勢。這些現象可以體現出ADSCs作為干細胞具有“歸巢”作用[33]，即在體內具有向創傷部位定向遷移的能力，但其具體機制尚不明確，可能與創傷引起的局部微環境改變有關。但是這種“歸巢”作用起效較慢，局部注射可能會發揮的更大效力。

4.2 缺氧環境對ADSCs的影響：ADSCs本身耐缺氧能力較強，在缺氧的環境中可以釋放抗氧化物質、自由基清除劑、分子伴侶、熱休克蛋白等，清除受損局部區域的細胞毒性物質，促進尚存活的物質復蘇[34]。在1%的低氧環境中培養ADSCs，能夠檢測到與血管增殖相關細胞因子表達的上調[35]，ADSCs 在2%的低氧環境中，VEGF和bFGF的分泌量要高于其在正常氧含量的環境，且細胞促膠原合成、促成纖維細胞的遷移能力更強[36]。Rehman等[37]的實驗顯示，在低氧環境中，ADSCs分泌的VEGF約為正常氧含量中的5倍，且能明顯促進血管內皮細胞的生長和減少內皮細胞凋亡。但是這種低氧環境對ADSCs分泌功能的影響機制尚不明確。然而可以預見，臨床應用前使用低氧環境處理ADSCs，以延長其生存能力和激發干細胞特性可能是一個行之有效的方法。但在創傷部位，組織的正常結構及血供遭到破壞后產生的低氧環境對ADSCs的影響還需進一步研究。

現在針對ADSCs的研究大多數是在體外環境中進行的，如何能在接近體內內環境的狀態下研究ADSCs的特性，特別是在病理狀態下的微環境中ADSCs將如何發揮作用，也是今后研究的方向之一。對于ADSCs的儲存條件有研究認為可利用深低溫保存ADSCs，其增殖分化潛能及旁分泌因子的特性不會受到影響[38]，也有利于其將來向商品化方向推廣。

4.3 ADSCs培養及其增殖的穩定性:對于ADSCs培養、增殖的穩定性問題，學者們各持己見。姚素艷等[39]為了檢測ADSCs長期培養后的細胞活力，用MTT法檢測了傳代后第3、6、9代細胞的活力，結果顯示培養的ADSCs生長狀態良好，在細胞活力方面第2～8代細胞無明顯差異，但第9代細胞活力開始下降。王先成等[40]通過培養發現ADSCs增殖速度穩定，細胞群體倍增時間約為29h，將細胞傳代20代后，細胞形態沒有明顯的改變，染色體核型分析結果表明細胞仍為正常的二倍體核型，傳至20代后，細胞可在體外擴增3.487×109倍。而有實驗結果發現，ADSCs在無任何干預因素的條件下持續傳至25代時多條染色體出現斷裂、畸變，呈現亞二倍體核型或超二倍體核型，甚至個別染色無法辨認，從而認為ADSCs在體外傳代的過程中并不能永久地維持穩定的二倍體結構，具有向腫瘤細胞發展的傾向[41]。ADSCs作為多能干細胞的一種，有著干細胞的共性，理論上具有無限增殖的能力，但從其臨床應用的價值來看，這種細胞治療的安全性應該是第一位的，所以對ADSCs在遺傳穩定性方面的研究需進一步明確，這也是其將來應用到臨床治療的前提條件。

綜上所述，ADSCs促進組織修復中血管生成的作用是可靠的，相信隨著對干細胞移植基礎研究的不斷深入，以及通過動物實驗和臨床實驗的不斷探索，ADSCs的實驗方法也會更加規范。雖然目前血管化的速度還無法完全滿足移植物對血供的要求，但這一問題可以通過預血管化方式進行彌補，對組織損傷的修復具有重要意義。

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[收稿日期]2012-02-06 [修回日期]2012-03-16

編輯/李陽利