高效液相色譜法測(cè)定抗腫瘤藥物HDZ126016的含量

摘 要 目的：建立用于測(cè)定抗腫瘤藥物HDZ126016含量的高效液相色譜方法。方法：采用Xtimate C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)為固定相，以乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鉀（三乙胺調(diào)節(jié)pH至7.5，60：40）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量20 μl。結(jié)果：在上述色譜條件下，HDZ126016主峰與相鄰雜質(zhì)分離良好，溶劑不干擾測(cè)定，在0.05～10 μg/ml濃度范圍內(nèi)，HDZ126016峰面積與濃度線性良好，r＝0.999 9（n=3），方法的回收率為99.89%～100.10％，RSD為0.36%～0.87％（n=3）。結(jié)論：該法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，可用于抗腫瘤藥物HDZ126016的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 抗腫瘤藥物 含量測(cè)定 高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533(2012)01-0013-03

Determination of anti-cancer drug

HDZ126016 by high performance liquid chromatography*

ZHANG Jian-ming1，2，REN Xiao-qing1，WANG Ke1，SHA Xian-yi1，F(xiàn)ANG Xiao-ling1

（1. Teaching and Research Group of Pharmaceutics，Institute of Pharmacy，F(xiàn)udan University，Shanghai，200032；

2. Shanghai Mental Health Center，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai， 201108）

ABSTRACT Objective: To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of anti-cancer drug HDZ126016. Methods: The HPLC assay was performed on a Xtimate C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） with the acetonitrile-10mmol/L potassium dihydrogen phosphate solution （adjusted the pH to 7.5 with triethanolamine） （40：60） as a mobile phase at detection wavelength of 250 nm. Results: The calibration curve was linear over the range of 0.05-10 μg/ml （r=0. 9999） for HDZ126016. The recovery rates were 99.89%～100.10％ with RSD 0.36%～0.87％（n=3）. Conclusion: The established HPLC method can be used for the determination of the candidate compound HDZ126016 .

KEY WORDS anti-cancer drug； high performance liquid chromatography；content determination

索拉菲尼（sorafenib）是一種多激酶抑制劑，可以通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體等而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并成為第一個(gè)被證實(shí)能改善晚期肝癌（HCC）患者生存的藥物[1]。但研究表明，索拉菲尼有致突變性、生殖毒性，大鼠和兔應(yīng)用索拉菲尼出現(xiàn)胚胎毒性、致畸性[2]。為降低索拉菲尼的毒副作用，增加藥物的藥理活性，對(duì)索拉菲尼的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，合成了新型抗腫瘤藥物HDZ126016。藥效學(xué)研究表明，HDZ126016活性大于索拉菲尼，毒副作用較低，開發(fā)前景廣闊。本文旨在建立用于測(cè)定HDZ126016含量的HPLC方法，并進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)研究，為HDZ126016的質(zhì)量控制提供一種準(zhǔn)確可靠的含量分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-15C高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）；SPD-10A 型紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器（日本島津株式會(huì)社），XW-80A 旋渦混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），BS- 210電子分析天平（Sartorius），DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.2 試藥

HDZ126016原料（山東醫(yī)工院提供，20101204-1，20101204-2），HDZ126016對(duì)照品（自制，99.50%）；乙腈為色譜純（沃凱，中國(guó)）。其余試劑為分析純，蒸餾水為三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鉀[三乙胺調(diào)節(jié)pH至7.5，60：40(V/V) ]。流速：1.0 ml/min。柱溫：40 ℃。進(jìn)樣量：20 μl。檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。在此條件下所得色譜圖（圖1），結(jié)果表明樣品中空白溶劑（a）和雜質(zhì)（c）對(duì)測(cè)定沒有干擾，專屬性良好。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以乙腈為溶劑配制濃度為50 μg/ml 的HDZ126016的乙腈對(duì)照品溶液，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。紫外掃描圖如圖2，HDZ126016在250 nm處有最大吸收峰，確定250 nm為含量測(cè)定檢測(cè)圖譜的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 溶液的制備

1）對(duì)照品溶液。精密稱取HDZ126016對(duì)照品約5 mg，置10 ml量瓶中，加乙腈適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml至100 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液。精密稱取HDZ126016樣品約5 mg，置10 ml量瓶中，加乙腈適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml至100 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

3）陰性對(duì)照溶液為乙腈，雜質(zhì)對(duì)照品為雜質(zhì)a。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取HDZ126016 50 mg，用乙腈配制成濃度為500 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。標(biāo)準(zhǔn)貯備液用流動(dòng)相配制成濃度為0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，于上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，重復(fù)3次。將HDZ126016色譜峰面積對(duì)濃度按最小二乘法進(jìn)行線性回歸，所得線性方程為：A= 83 686C + 2 713.7；R2=0.999 9。結(jié)果表明，候選化合物HDZ126016在0.05～10 μg/ml 濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積（A）與濃度（C）呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別配制濃度為低（4 μg/ml）、中（5 μg/ml）、高（6 μg/ml）3種濃度的對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，并分別計(jì)算峰面積的RSD值，求得的RSD值分別為3.4%，0.51%和1.9%，精密度符合含量測(cè)定的要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批HDZ126016（批號(hào)20101204-1）原料藥5 mg置10 ml量瓶中，加乙腈適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml至100 ml量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為5 μg/ml的樣品溶液，同樣平行制備6份樣品溶液，分別測(cè)定含量，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD為0.37%，測(cè)定結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性測(cè)定項(xiàng)下的樣品溶液，并于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h分別按含量檢測(cè)方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，RSD為0. 46% （n=9）。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 靈敏度

以信噪比為3：1時(shí)相應(yīng)的濃度確定檢測(cè)限為4.3 ng/ml，以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度確定定量限為13.2 ng/ml。

2.9 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取HDZ126016原料藥2 mg于10 ml量瓶中，分別精密加入HDZ126016對(duì)照品2 mg、3 mg、4 mg，各3份，以乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取溶液1 ml至100 ml量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液，取20 μl 進(jìn)樣，記錄色譜圖；另精密稱取HDZ126016對(duì)照品適量，制備成濃度為5 μg/ml的溶液為對(duì)照品溶液，取20 μl 進(jìn)樣，記錄色譜圖，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各樣品的檢出量，計(jì)算回收率，結(jié)果表明HDZ126016低、中、高3種濃度的平均回收率分別為100.4%，99.77%和99.94%；RSD分別為0.96％，1.08％和0.91％，結(jié)果見表1。可見該方法的準(zhǔn)確性可滿足含量測(cè)定的要求。

2.10 含量測(cè)定

對(duì)兩批HDZ126016原料藥，按照2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備方法制備供試品溶液與對(duì)照品溶液，并分別測(cè)定并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

3 討論

本品為水難溶性藥物，在流動(dòng)相中的溶解度不好，因此，樣品制備時(shí)選擇乙腈為溶劑。

以乙腈為溶劑配制濃度為50 μg/ml 的HDZ126016的乙腈對(duì)照品溶液，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描， HDZ126016在紫外區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)分別為210 nm與250 nm，并且其最大吸收度基本一致，因210 nm屬近紫外區(qū)，含量測(cè)定時(shí)干擾較大，因此選擇250 nm為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

HDZ126016為自行研制的新分子實(shí)體藥物，市場(chǎng)尚無(wú)其對(duì)照品銷售。因此，本文按照對(duì)照品制備要求，將HDZ126016原料藥樣品（純度為99.50%）干燥至恒重得試驗(yàn)用對(duì)照品。

在整個(gè)方法建立過程中，采用柱恒溫的方法，可以避免日內(nèi)和季節(jié)溫差的變化造成數(shù)據(jù)的不穩(wěn)定。

本方法操作簡(jiǎn)單，分析快速，并且方法學(xué)研究結(jié)果表明該方法的線性、精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度等均符合含量測(cè)定的要求，可用于抗腫瘤藥物HDZ126016的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

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[2]Escudier B，Szczylik C，Eisen T，et al. Randomized phase III trial of the Raf kinase and VEGFR inhibitor sorafenib (BAY 43-9006) in patients with advanced renal cell carcinoma (RCC)［J］．J Clin Oncol，2005，23(16)：16.

（收稿日期：2011-09-22）