PCNA、Caspase-3和Bcl-2在不同類型IgA腎病中的表達及意義

[摘要] 目的 觀察增殖細胞核抗原（PCNA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）在不同病理學類型IgA腎?。↖gAN）中的表達，并探討其意義及與患者腎功能臨床指標之間的關系。 方法 采用免疫組化法測定54例IgAN患者腎組織PCNA、Caspase-3和Bcl-2的水平，收集患者血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量的臨床檢測結果。 結果 （1）IgA腎病患者腎組織中PCNA的表達從低到高依次為Ⅰ級（0.09±0.03）、Ⅱ級（0.12±0.02）、Ⅴ級（0.13±0.01）、Ⅲ級（0.28±0.08）、Ⅳ級（0.54±0.03），其中Ⅰ級與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級間均有統計學意義（均P < 0.01）；Caspase-3與Bcl-2的表達隨級別增加而逐漸增高：Caspase-3的表達依次為Ⅰ級（0.08±0.01）、Ⅱ級（0.11±0.02）、Ⅲ級（0.13±0.08）、Ⅳ級（0.20±0.01）、Ⅴ級（0.35±0.01），其中Ⅰ級與其他各級間比較差異均有統計學意義（均P < 0.01）。Bcl-2的表達依次為Ⅰ級（0.09±0.02）、Ⅱ級（0.11±0.01）、Ⅲ級（0.15±0.01）、Ⅳ級（0.29±0.01）、Ⅴ級（0.32±0.01），其中Ⅰ、Ⅱ級與Ⅲ～Ⅴ級間均有統計學意義（均P < 0.01）。三種蛋白Ⅲ、Ⅳ級的表達為PCNA＞ Bcl-2＞Caspase-3，Ⅴ級的表達為Caspase-3＞Bcl-2＞PCNA，差異均有統計學意義（P ＜ 0.01）。（2）Scr、BUN、24 h尿蛋白定量從Ⅰ級到Ⅴ級均逐漸增高，Scr的水平依次為65.08±14.11、81.53±21.71、133.86±69.36、147.56±52.69、280.03±137.81，其在Ⅴ級的水平與其他各組間比較均有統計學意義（P ＜ 0.01）；BUN的水平依次為4.77±1.39、6.16±2.48、6.97±3.60、9.44±2.80、13.30±6.32，其Ⅴ級水平與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級間比較均有統計學意義（P ＜ 0.01）；24 h尿蛋白定量的水平依次為0.84±0.33、2.50±1.08、3.35±0.82、3.54±0.77、4.66±1.42，其Ⅰ級的水平與其他各級間及Ⅴ級與Ⅱ、Ⅲ級間均有統計學意義（P ＜ 0.01）。（3）PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關（P ＜ 0.01），PCNA的表達與Caspase-3呈正相關（P ＜ 0.05）。 結論 PCNA、Caspase-3和Bcl-2隨著IgAN Ⅰ~Ⅴ級表達水平逐漸增加，提示IgAN病程進展及腎功能的損傷可能與細胞凋亡增殖失衡有關。

[關鍵詞] IgA腎??；凋亡；PCNA；Caspase-3；Bcl-2

[中圖分類號] R692.310 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）06-0001-03

Expression and its significance of Caspase-3、Bcl-2 and PCNA in the various pathological type of IgA nephropathy

WANG Chenjing WEI Jianping ZHANG Xiaoqin GAO Lifang

Department of Pathology， the Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of Caspase-3、Bcl-2 and PCNA in the various pathological type of IgA nephropathy（IgAN）， and discuss the relationship between clinical index and Caspase-3、Bcl-2 and PCNA. Methods The expression of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 in 54 cases of renal setions was examined by immunohistochemistry. Collected the results of clinical indexes：serum creatinine（Scr）、urea nitrogen（BUN）、24 hour urine protein quant. Results （1）In IgA renal tissue the expression of PCNA from low to high were levelⅠ（0.09±0.03）、levelⅡ（0.12±0.02）、levelⅤ（0.13±0.01）、level Ⅲ（0.28±0.08）、level Ⅳ（0.54±0.03）， between grade Ⅰ and grade Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ， the expression of PCNA were both significantly different （P < 0.01）. The expression of Caspase-3 and Bcl-2 were both gradely increased followed the level of IgAN. The expression of Caspase-3 in turn were 0.08±0.01、0.11±0.02、0.13±0.08、0.20±0.01、0.35±0.01， between level Ⅰand other levels which were both statistically significant （P < 0.01）. The expression of Bcl-2 in turn were 0.09±0.02、0.11±0.01、0.15±0.01、0.29±0.01、0.32±0.01， between grade Ⅰ、Ⅱand grade Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ which were both statistically significant （P < 0.01）. （2）From grade Ⅰ to Ⅴ， Scr、 BUN、 24 hour urine protein quant were gradually increased， Scr levels were 65.08±14.11、81.53±21.71、133.86±69.36、147.56±52.69、280.03±137.81， its level between gradeⅤand other groups were significantly different （P < 0.01）; BUN levels were 4.77±1.39、6.16 ±2.48、6.97±3.60、9.44±2.80、13.30±6.32， its level between grade Ⅴ and grade Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ were significantly different （P < 0.01）; 24 hour urine protein quant levels were 0.84±0.33、2.50±1.08、3.35±0.82、3.54±0.77、4.66±1.42， its level between grade Ⅰ and other levels and between grade Ⅴ and gradeⅡ、Ⅲ were all significantly different （P < 0.01）. （3）The expression of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 were positively correlated with the level of Scr、BUN and 24 hour urine protein quant （P < 0.01）. The expression of PCNA was positively correlated with Caspase-3. Conclusion The expressions of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 are gradually increased with ⅠtoⅤIgA nephropathy. The progression of IgAN and the damage of renal function may be connected with the imbalance between proliferation and apoptosis.

[Key words] IgA nephropathy; Apoptosis; PCNA; Caspase-3; Bcl-2

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是一組以腎小球系膜區IgA沉積、同時伴系膜細胞增生和系膜基質擴張為主要病理改變的原發性腎小球腎炎。研究表明，不同病理學類型IgAN由于病理改變不同，表現出的細胞凋亡與增殖不同，凋亡機制的反應性存在著明顯的差異[1]。但PCNA、Caspase-3和Bcl-2與不同類型IgAN關系的研究報道較少。本研究觀察PCNA、Caspase-3和Bcl-2在不同病理類型IgA腎病的變化，并探討其意義及與患者腎功能臨床指標間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

54例IgAN患者腎活檢標本均選自山西醫科大學第二醫院病理科2006年7月～2010年7月病理科存檔資料。其中男38例，女16例，平均年齡31.5歲。均除外紫癜性腎炎、狼瘡腎炎、乙肝病毒相關性腎炎及肝病性腎小球硬化癥等繼發性腎病。所有標本均行光鏡、直接免疫熒光和透射電鏡檢查。光鏡經常規石蠟組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）、過碘酸雪夫反應（PAS）、過碘酸六胺銀染色（PASM）及馬松染色（Masson），直接免疫熒光檢查采用OCT 包埋，冰凍切片觀察IgG、IgM、IgA、C3、C1q、FRA；電鏡檢查經戊二醛固定，制作切片并觀察。按照1997年Hass分級標準對IgAN進行病理組織學分級：輕微病變型（Ⅰ級）9例；局灶節段性腎小球硬化樣型（Ⅱ級）12例；局灶增生型（Ⅲ級）12例；彌漫增生型（Ⅳ級）11例；進行性慢性腎炎型（Ⅴ級）10例。

1.2 實驗方法

1.2.1 腎組織PCNA、Caspase-3和Bcl-2的檢測 將存檔的石蠟包埋標本常規制片，采用免疫組化染色二步法染色。每例切片隨機選取5個200倍視野下分析，所有經免疫組化染色的結果用Image-Pro plus（IPP）圖像處理系統測定腎小球Caspase-3、Bcl-2的平均光密度，以反映Caspase-3、Bcl-2的表達量。PCNA的表達情況用球內陽性胞數/總細胞數（%）表示。PCNA、Caspase-3和Bcl-2抗體均購于武漢博士德生物技術開發有限公司，增強劑、二抗、DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 臨床指標的檢測 包括Scr、BUN、24 h尿蛋白定量。

1.3 統計學處理

實驗測定值計量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用Bonferroni法。各指標間相關性采用Spearson相關性分析。全部數據應用SPSS 13.0軟件包分析， P < 0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 不同病理學類型IgA腎病中PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達

見表1。表1顯示，PCNA、Caspase-3在Ⅰ級與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級間均有統計學意義（均P < 0.01）。Bcl-2在Ⅰ級、Ⅱ級與Ⅲ～Ⅴ級間差異有統計學意義（均P < 0.01）。在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級的三種蛋白表達間也均有統計學意義（P ＜ 0.01）。IgAN腎組織內PCNA、Caspase-3和Bcl-2均主要表達于腎小球系膜細胞和內皮細胞。PCNA為細胞核陽性，Caspase-3陽性部位為細胞核或細胞漿，Bcl-2陽性定位于細胞漿。

2.2 不同病理學類型IgA腎病臨床指標的比較

見表2。表2顯示，Scr在Ⅴ級的水平與其他各級間均有統計學意義（P ＜ 0.01）；BUN在Ⅴ級的水平與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級間均有統計學意義（P ＜ 0.01）；24 h尿蛋白定量在Ⅰ級的水平與其他各組間及在Ⅴ級與Ⅱ、Ⅲ級間均有統計學意義（P ＜ 0.01）。

2.3 三種蛋白及腎功能臨床指標間的相關性

見表3。表3顯示 PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量間均呈正相關。

2.4 PCNA、Caspase-3、Bcl-2表達之間的相關性

見表4。表4顯示，PCNA的表達與Caspase-3呈正相關。

3 討論

增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是反映細胞增殖活性的一項良好指標，它與DNA聚合酶δ結合，以引導完成DNA的復制[2]，其存在直接表明細胞處于增殖周期，從而有助于了解各種腎臟疾病的發病過程。

Sebo等[3]認為腎小球增殖指數與腎小球組織病變程度有關。本研究結果顯示，在輕微病變型（Ⅰ級）PCNA表達較少，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級其表達逐漸增多，而到進行性慢性腎炎型（Ⅴ級）由于過度的增殖導致纖維化和瘢痕形成，腎小球細胞增殖能力減弱，其表達又明顯減少，提示IgAN腎小球細胞增殖程度隨腎臟病變加重進行性增加。這與Sebo的觀點類似。

Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者[4]。大多數觸發細胞凋亡的因素最終均需要通過Caspase-3介導的信號傳導途徑導致細胞凋亡[5]。本研究結果顯示，Caspase-3隨著病變程度加重，其表達逐漸增高，Ⅰ級與其他各級間均有統計學意義（P ＜0.01）。Caspase-3的表達與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關（P ＜ 0.01），與PCNA的表達也呈正相關，表明Caspase-3可能參與了IgAN的凋亡過程，且隨著病變加重、腎功能降低、腎小球系膜細胞和內皮細胞增殖增多，其觸發凋亡的作用也逐漸增強，以平衡腎小球細胞數，防止腎小球細胞過度增殖。

Bcl-2是Bcl-2蛋白質家族中抗凋亡的成員之一，研究認為，Bcl-2 可通過抑制內源性核酸內切酶活性，阻止細胞色素C、黃素蛋白（AIF）從線粒體釋放入細胞質，使凋亡效應蛋白酶鏈 Caspase-3 不能激活以及抗氧化活性等機制發揮抑制的凋亡作用[6]。本研究結果顯示，Bcl-2的表達從Ⅰ級到Ⅴ級逐漸增高，且從Ⅱ級到Ⅳ級間均有統計學意義，可能是由于細胞凋亡不斷增多，Bcl-2也相應啟動其抑制凋亡的機制，以防止腎小球細胞過度凋亡。

在IgAN腎組織中Ⅰ、Ⅱ級PCNA、Caspase-3、與Bcl-2的表達無明顯差異，提示在病變初期細胞增殖、凋亡及抑制凋亡的機制處于相對平衡的狀態。在Ⅲ、Ⅳ級三種蛋白的表達為PCNA＞Bcl-2＞Caspase-3（P ＜ 0.01），提示在疾病進展期細胞增殖多于凋亡，可能是由于雖然Caspase-3隨病變進展凋亡機制增強，但Bcl-2蛋白抑制Caspase-3激活進而抑制凋亡的作用也隨之增強，且抑制凋亡的作用大于激活從而導致腎小球細胞增殖與凋亡失衡。在Ⅴ級三種蛋白的表達為Caspase-3＞Bcl-2＞PCNA（P ＜ 0.01），可能提示在病變終末期Bcl-2抑制Caspase-3的作用減弱，導致Caspase-3過度激活進而引起腎小球細胞的過度凋亡。過度的凋亡又導致瘢痕區內腎小球固有細胞的消除，加重病情進展[7]。亦有研究證實， 在多種動物模型及 IgAN等臨床病例中均可觀察到腎實質細胞的過度凋亡與病程的進展明顯相關[8]。但本實驗中僅PCNA的表達與Caspase-3呈正相關，Bcl-2 與Caspase-3、PCNA并無相關性，所以在IgAN不同類型腎組織Caspase-3的激活是否受Bcl-2調節還需進一步研究證實。

Scr是判斷腎臟疾病嚴重程度的可靠指標。Li等[9]發現Scr與IgA腎病組織學分級呈正相關。Eiro等[10]認為尿蛋白排泄量與腎小球和腎小管間質組織學病變分級、Scr水平具有相關性，是IgA腎病進展為ESRD的獨立危險因素。本研究結果顯示，Scr、BUN、24 h尿蛋白定量在IgANⅠ～Ⅴ級隨病理學分級均逐漸增高，且IgANⅠ～Ⅴ級PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關，與上述觀點相似。在Ⅰ、Ⅱ級，三種蛋白的表達無統計學意義，提示增殖與凋亡處于相對平衡狀態，腎功能損傷也相對較輕。在Ⅲ、Ⅳ級PCNA的表達明顯大于Caspase-3，提示過度增殖損傷了腎功能從而導致Scr、BUN、24 h尿蛋白定量水平升高，在Ⅴ級PCNA的表達明顯低于Caspase-3，提示過度凋亡進一步加重了腎功能損傷。

總之，細胞增殖和凋亡間的相對平衡對維持正常細胞數有著重要的意義，過度增殖或過度凋亡都會造成IgAN病程進展及腎功能的損傷。

[參考文獻]

[1] 姚舒蕾，李榮山，張小琴，等. 不同類型 IgA 腎病細胞增殖與凋亡關系的研究[J]. 中國藥物與臨床，2008，8（2）：131-133.

[2] Dixon D，Flake GP，Moore AB，et al. Cell proliferation and apoptosis in human uterine leiomyomas and myometria[J]. Virchows Arch，2002，441（1）：53-62.

[3] Sebo T，Grande J，Rastogi S，et al. Assessment of PCNA and Ki67（MIB1） quantitation by image analysis in predicting adverse outcome of IgA nephropathy[J]. Lab Invest，1994，70：160.

[4] Mclaughlin B，Hartnett KA，Erhardt JA，et al. Caspase-3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning[J]. Pro Natl Acad Sci USA，2003，100（2）：715-720.

[5] Woo M，Hakem R，Soengas MS，et al. Essential contribution of caspase3/CPP32 to apoptosis and its associated nuclear changes[J]. Genes Dev，1998，12（6）：806-819.

[6] Kawasaki T，Ishihara K，Ago Y，et al. Protective effect of the radical scavenger edaravone against methamphetamine-induced dopaminerdic neurotoxicity in mouse stritum[J]. Eur J Pharmacol，2006，542（1-3）：92-99.

[7] 王瓊書，杜鵑. 細胞凋亡與腎臟疾病[J]. 實用醫學雜志，2004，20（10）：1193-1194.

[8] Wang W，Alex T，Divjak M，et al. Altered signaling and regulatory mechanisms of apoptosis in focal and segmental glomerulosclerosis[J]. J Am Soc Nephrol，2001，12（7）：1422-1433.

[9] Li PK，Ho KK，Szeto CC，et al. Prognostic indicators of IgA nephropathy in the Chinese-cliniea1 and pathological perspectives[J]. Nephrol Dial Transplant，2002，17（1）：64-69.

[10] Eiro M，Katoh T，Kuriki M，et al. The product of duration andamount of proteinuria（proteinuria index） is a possible markerfor glomerula and tubuloin￡erstitIal damage in IgA nephropathy[J]. Nephron，2002，90（4）：432-441.

（收稿日期：2011-12-05）