黃芩苷對白血病細胞耐藥株逆轉耐藥效果及機制研究

第四軍醫大學西京醫院血液科（西安710032） 楊莉潔 趙 挺 白慶咸 董紅娟

目前白血病的治療大多采用聯合化療，盡管生存期已明顯延長，但仍有逾30%的病人發生多藥耐藥而耐藥細胞是否具有逆轉作用及機制如何仍未有文獻報道。本課題擬觀察黃芩苷對人白血病耐藥株K562／Adr的逆轉作用并對其可能的機制進行初步探討。導致化療失敗。多藥耐藥（Multidrug resistanee，MDR）已成為白血病化療及白血病病人長期無病生存的主要障礙［1］。因此，尋找克服 MDR的治療措施對白血病的治療藥物具有重大意義。目前MDR逆轉劑主要存在的問題有效果不佳，部分逆轉藥物副作用較大等不足，研究報道，一些中藥提取物對腫瘤的多藥耐藥具有逆轉作用［2］，且此類藥物毒副作用明顯低于經典逆轉劑，已逐漸成為MDR逆轉劑篩選的熱點。黃芩苷是由中藥黃芩中提取出來的重要成分之一，有研究顯示它可能具有逆轉耐藥的作用［3］，但其對白血病

材料與方法

1 細胞系 人白血病親本細胞株K562為本實驗室存留，耐藥株細胞K562／Adr購于南京凱基生物公司。

2 主要試劑 黃芩苷（純度95%）購于Sigma公司，逆轉錄試劑盒購于大連寶生物公司，Trizol購于Invitrogen公司。PCR Taq酶購于大連寶生物公司。

3 方 法

3．1 抑制率及逆轉作用評價：取對數生長期的耐藥細胞K562／Adr，細胞密度5×104／ml，接種于96孔板內，待細胞長到約80%匯合率時以倍比稀釋的方法由高到低分別加入由含5、10μg／ml黃芩苷完全培養基配制的不同濃度的阿霉素（Adriamycin，Adr）（800、400、200、100、50μg／ml），另設空白對照組（細胞＋培養液）、調零孔（培養液），藥物作用48h后，使用MTT法檢測各組的抑制率：抑制率（%）（Inhibition rate，IR）＝（1－實驗孔OD值／對照孔OD值）×100%；耐藥指數（Resistance index，RI）＝IC50（耐藥細胞）／IC50（親本細胞）；逆轉倍數（Reversal fold，RF）＝IC50（耐藥細胞單用化療藥物）／IC50（耐藥細胞聯用化療藥物＋逆轉劑）；相對逆轉率（relative reversal rate，RRR）＝（IC50（耐藥株單用化療藥）－IC50（耐藥株化療藥＋逆轉劑））／（IC50（耐藥株單用化療藥）－IC50（親本株單用化療藥）），RRR≥1代表完全逆轉，RRR﹤1代表部分逆轉。

3．2 K562／ADR細胞中ADR蓄積測定：收集對數生長期的K562／ADR細胞，以1×106／孔接種于6孔板，加入不同濃度黃芩苷，懸于含5μg／ml ADR的完全培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培養2h后，用冰冷的PBS洗滌細胞2次，重懸于1ml冰冷的PBS中，立刻用流式細胞儀檢測細胞內ADR的蓄積，每組各檢測10 000個細胞。

3．3 MDR相關基因的檢測：取對數生長期的K562／Adr，以0．25%的胰蛋白酶消化后形成細胞懸液，接種6孔板內，細胞密度5×105／ml，2ml／孔，待細胞長到約80%匯合率時以倍比稀釋的方法由高到低分別加入由完全培養基配制的不同濃度的黃芩苷（10、5μg／ml），另設空白對照組（細胞＋培養液），藥物作用48h后，TRizol法提取RNA，RT－PCR檢測 MDR相關基因MDR1、MRP以及LRP基因的表達水平，以GAPDH為內對照，4個基因相應的PCR引物，見表1。

表1 目的基因引物序列

4 統計學方法 所有數據使用SPSS 17．0進行統計學分析，細胞增殖抑制率、IC50值比較采用兩樣本t檢驗，基因表達水平先采用Image J軟件計算出灰度值，再采用t檢驗分析統計學差異。以P＜0．05為差異有顯著性。

結 果

1 阿霉素對K562細胞和K562／Adr細胞的抑制作用：MTT結果顯示Adr作用于K562／Adr耐藥細胞的IC50值約為12．099μmol／ml，作用于 K562細胞的IC50值為0．696μmol／ml，K562／Adr細胞對阿霉素的敏感性顯著低于K562細胞（P＜0．001），其耐藥倍數為17．384倍（圖1）。

圖1 阿霉素對K562細胞和K562／Adr細胞的抑制作用

2 黃芩苷對K562細胞和K562／Adr細胞的抑制作用：MTT結果顯示黃芩苷對K562親本細胞及耐藥細胞均具有抑制作用，對K562／Adr耐藥細胞的IC50值約為16．223μg／ml，對K562細胞的IC50值僅為0．091μg／ml（圖2）。

圖2 黃芩苷對K562細胞和K562／Adr細胞的抑制作用

3 黃芩苷對K562／Adr細胞的逆轉作用：黃芩苷（10μg／ml、20μg／ml）聯合 Adr（0．5－12．8μmol／ml）（簡稱AB10組、AB20組）對K562／Adr的抑制率分別為（3．85%、6．39%、17．14%、34．26%、52．99%、70．53%和88．18%）以及（5．86%、11．38%、30．43%、51．13%、74．44%、88．75%和94．21%），聯用黃芩苷后的IC50分別為2．859μmol／ml及1．549μmol／ml，較單用Adr具有顯著性差異（P＜0．01，圖3）。

圖3 黃芩苷對K562／Adr細胞的逆轉作用

RF（AB10）為4．230，RF（AB20）為7．812；RRR（AB10）及RRR（AB20）分別為0．81及0．93，黃芩苷（10μg／ml、20μg／ml）對 K562／Adr的耐藥逆轉為部分逆轉作用。

4 黃芩苷對K562／Adr細胞內Adr蓄積的影響：0、10、20μg／ml黃芩苷分別與5μmol／ml Adr作用2h后，K562／ADR細胞內Adr的熒光強度分別為1．058±0．155、1．525±0．213和2．217±0．356，各劑量組之間存在顯著性差異 （P＜0．05）（圖4）。

5 黃芩苷對K562／Adr細胞 MDR1、MRP1以及LRP基因表達的影響：RT－PCR結果顯示10μg／ml和20μg／m黃芩苷處理后，K562／Adr細胞中 MDR1以及MRP1mRNA的表達水平較對照組明顯降低，其中以MDR1表達變化最為顯著；LRP mRNA表達水平未見明顯改變（圖5）。因此，篩選安全有效的MDR逆轉劑成為了腫瘤化療研究的一大熱門課題。

圖5 黃芩苷對MDR1、MRP1以及LRP基因表達的影響

黃芩苷（Baicalin）是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來的黃酮類化合物［4］，根據中醫中藥理論，黃芩具有解熱、降壓、利膽、保肝、鎮靜、抗菌等藥理作用，而黃芩苷則是黃芩的一個重要有效成分［5］。由于該藥物已廣泛應用于臨床，毒副作用較低，因此具有良好的MDR逆轉劑前景。本課題選取白血病耐藥細胞株，根據經典的MDR逆轉實驗對黃芩苷逆轉白血病耐藥細胞株MDR的效果進行了評估，并對其作用機制進行了初步的探討。實驗結果顯示，黃芩苷對白血病耐藥細胞株K562／Adr具有顯著的逆轉作用。在不直接引起細胞凋亡的濃度下（10、20μg／ml），黃芩苷可對白血病耐藥細胞的MDR進行部分逆轉，顯著提高細胞內化療藥物的濃度。

討 論

多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥后對其它結構、細胞靶點和作用機制不同的多種抗癌藥物產生交叉耐藥的現象。截至目前，腫瘤研究者發現了諸多MDR逆轉劑，如最經典的鈣通道阻滯劑維拉帕米，還有其它如鈣調節蛋白抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、寡核苷酸、免疫抑制劑、甾體類激素等。但是這些具有逆轉MDR作用的藥物大多存在毒副作用較大的缺陷，限制了其在臨床的進一步應用。

MDR的產生是多機制、多途徑、多環節的過程，目前認為白血病細胞多藥耐藥的機制與ATP結合的盒式（ATP binding cassette，ABC）運輸蛋白家族密切相關，該蛋白家族的主要成員包括：①P－糖蛋白（P－gp）介導的藥物泵出；②MRP介導的藥物泵出；③LRP介導的藥物轉運；④乳癌耐藥蛋白BCRP的參與等。不同的藥物泵化療藥的作用也不盡相同，例如P－gp主要泵出蒽環類、生物堿類藥物，MRP轉運多柔比星的作用更為明顯，而LRP則與順鉑類藥物耐藥關系密切。為了探討黃芩苷逆轉作用的分子機制，我們采用RTPCR法檢測了白血病耐藥細胞株在黃芩苷處理后耐藥相關基因的變化。實驗結果顯示黃芩苷可顯著下調MDR1基因的表達，對MRP基因也有一定的抑制作用，但對LRP基因的影響不甚明顯。這提示黃芩苷的MDR逆轉作用可能主要在于抑制了耐藥細胞中MDR1基因的表達。阿霉素屬于抗生素類抗腫瘤藥物，已有研究證實P－cp可將阿霉素泵出細胞外而導致MDR［6］，因此黃芩苷抑制MDR1基因的表達后腫瘤耐藥細胞中的阿霉素蓄積水平升高，保證了藥物的殺傷作用。

［1］ Norgaard JM，Hokland P．Biology of multiple drug resistance in acute leukemia［J］．Int J Hematology，2000，72（3）：290－297．

［2］ Efferth T，Davey M，Olbrich A．Activity of drugs from traditional Chinese medicine toward sensitive and MDR1－or MRP1－overexpressing multidrug－resistant human CCRF－CEM leukemia cells［J］．Blood Cells Molecules and Diseases，2002，28（2）：160－168．

［3］ 張慧珠，楊 林，任雷鳴，等．中藥活性成分逆轉腫瘤細胞多藥耐藥作用的體外篩選［J］．華北煤炭醫學院學報，2003，5（3）：265－267．

［4］ 楊亞麗，吳 芳，楊瑞瑞．不同采收期黃芩HPLC指紋圖譜比較研究［J］．陜西中醫，2011，32（7）：901－902．

［5］ 張喜平，田 華，程琪輝．黃芩苷的藥理作用研究現狀［J］．中國藥理學通報，2003，19：1212－1215．

［6］ Kanagasabai R，Krishnamurthy K，Druhan LJ，et al．Forced expression of heat shock protein 27（Hsp27）reverses P－Ggycoprotein（ABCB1）－mediated drug efflux and MDR1gene expression in adriamycin－resistant human breast cancer cells［J］．Journal of Biological Chemistry，2011，286（38）：33289－33300．