卡托普利對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

蔣賢忠，趙競，金可可，李劍敏，趙晨晨，曾玉萍，樓帥，邱曉曉

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.第一臨床醫學院；2.病理生理學教研室）

糖尿病心肌病（diabetes cardiomyopathy， DC）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的并發癥之一，可發展為心力衰竭，是導致DM患者死亡的主要原因。研究表明，細胞凋亡參與了DC的發生、發展[1]。血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）能有效逆轉DC心臟重構，具有明顯的心肌保護作用[2]，但其在DC細胞凋亡方面的研究報道較少。本實驗以鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立DM大鼠模型，觀察ACEI類藥物卡托普利（captopril）對DM心肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響，并探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康SPF級成年雄性SD大鼠30只，體質量180～220 g，由溫州醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙2010-0150）。

1.2 主要試劑 卡托普利（規格：25 mg/片）購自常州制藥廠；STZ及枸櫞酸鈉分析純購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自北京中杉生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；BeyoECL Plus（免疫印跡化學發光試劑盒）購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 動物分組及模型建立 健康SPF級成年雄性SD大鼠30只，隨機分成正常對照組（NC組）10只和造模組20只。造模組大鼠禁食12 h后，STZ按65 mg/kg劑量腹腔注射，注射后72 h測血糖在13.8 mmol/L以上者為造模成功。NC組則給予等容積的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。成功模型大鼠隨機分為DM組、卡托普利組（Cap組）。Cap組按50 mg/（kg·d）劑量灌胃給予卡托普利，DM組和NC組則給予等容積的0.9%氯化鈉溶液。所有動物自由進食、飲水，飼養，每2周測血葡萄糖一次。飼養12周后行股動脈放血處死大鼠。

1.4 大鼠生長過程相關指標的測定 大鼠精神狀態、體質量監測。

1.5 大鼠血糖水平的測定 每隔2周行斷尾采血法（采用Johnson穩步倍加血糖儀）測定大鼠血糖一次，動態監測大鼠血糖水平的變化。

1.6 原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測心肌組織細胞凋亡 按試劑盒說明書操作。顯微鏡下細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即心肌組織凋亡細胞。隨機計算5個高倍視野（×400）下的凋亡細胞數，凋亡指數（apoptotic index，AI）以凋亡細胞/100個細胞（%）表示。

1.7 Western blot法檢測心臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達 大鼠處死后立即取出心臟，冰浴上取左心室前壁組織，將所取組織于-70 ℃儲存備用，每組各3只。全細胞裂解液提取心臟組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h后ECL發光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統分析蛋白條帶的光密度值，以GADPH為內參照進行蛋白半定量。

1.8 心臟組織超微結構觀察 取左心室前壁1 mm×1 mm×1 mm大小的組織2～3塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水后Epon812包埋，超薄切片，醋酸硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.9 統計學處理方法 采用SPSS 17.0統計軟件分析。所有數據進行正態性檢驗，用±s表示。多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet’s T3檢驗。

2 結果

2.1 一般情況 NC組大鼠精神活躍，動作自如，反應靈敏，毛發平伏有光澤，生長速度較快；DM組大鼠出現明顯多飲、多食、多尿癥狀，精神萎靡，動作遲緩，反應遲鈍，毛發無光澤，弓背蜷體，體質量較NC組明顯減輕；Cap組較DM組多飲、多食、多尿癥狀減輕，精神較活躍，活動度較好，毛發較有光澤，體質量減輕情況改善。三組大鼠12周的體質量變化見圖1。

2.2 血糖水平的變化 NC組大鼠血糖正常，很穩定；與NC組相比，DM組、Cap組大鼠血糖顯著升高（均P<0.05）；與DM組比較，Cap組大鼠血糖升高幅度降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖2。

2.3 心臟組織細胞凋亡檢測 NC組少量細胞凋亡；DM組細胞凋亡較NC組明顯增加（P<0.05）；Cap組細胞凋亡較DM組明顯減少，但仍高于NC組（P<0.05）。結果見表1、圖3。

圖1 各組大鼠體質量變化曲線

圖2 三組大鼠血糖的變化曲線

表1 各組大鼠心臟組織細胞AI、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白比較（n=10±s）

表1 各組大鼠心臟組織細胞AI、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白比較（n=10±s）

與NC組比：aP<0.05；與DM組比：bP<0.05

Bcl-2 0.880±0.156 0.613±0.032a 0.900±0.046b組別NC DM Cap AI(%)1.93±0.60 30.62±2.05a 23.45±1.70ab Bax 0.683±0.038 1.177±0.112a 0.817±0.064b Caspase-3 0.297±0.085 0.930±0.168a 0.433±0.205b

2.4 Western blot法檢測心臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達 與NC組相比，DM組心臟組織Bcl-2蛋白表達明顯減少，Bax、Caspase-3蛋白表達明顯增加（均P<0.05）；與DM組相比，Cap組心臟組織Bcl-2蛋白表達明顯增加，Bax、Caspase-3蛋白表達明顯減少（均P<0.05）。結果見表1、圖4-6。

2.5 心臟組織超微結構改變 NC組心肌肌原纖維豐富，肌絲分布均勻；線粒體膜完整，嵴排列規則；微血管基底膜連續完整。DM組心肌細胞腫脹，肌原纖維灶性溶解，肌絲排列紊亂，部分斷裂；線粒體腫脹，嵴排列紊亂甚至斷裂，空泡形成；間質膠原增生，微血管基底膜增厚。Cap組心肌肌原纖維部分排列紊亂；線粒體腫脹減輕，少部分嵴斷裂；微血管基底膜增厚減輕。結果見圖7。

圖4 Western blot法檢測各組大鼠心臟組織Bcl-2蛋白的表達

圖5 Western blot法檢測各組大鼠心臟組織Bax蛋白的表達

圖6 Western blot法檢測各組大鼠心臟組織Caspase-3蛋白的表達

圖7 各組大鼠心肌細胞超微結構變化（電鏡，×10000）

3 討論

DC是指DM患者心肌原發性損傷引起廣泛的結構異常，最終引起左心室肥厚，舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病狀態，由Rubler于1972年最早提出。但迄今為止，其發生機制尚未完全闡明，可能機制包括心肌細胞代謝紊亂、氧化應激、細胞內鈣超載、間質纖維化、心臟自主神經病變等[3]。研究發現，細胞凋亡參與DC的發生和發展，長期高血糖導致的心肌細胞凋亡是受基因調控及一系列蛋白酶形成的級聯反應過程[1]。

Bcl-2基因家族是主要的凋亡調控蛋白，Bcl-2是首個被確認有抑制凋亡作用的基因，其抗凋亡的機制主要是：①直接抗氧化作用；②維持細胞鈣穩態；③抑制Caspases的激活；④抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質，如細胞色素C和凋亡誘導因子（AIF）的釋放；⑤抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的細胞毒作用。Bax亦為Bcl-2基因家族成員，含有與Bcl-2基因一致的BH1、BH2、BH3三個同源區域，但其作用與Bcl-2基因相反，屬于促凋亡基因。Bcl-2高表達時，可形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體，也可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，均抑制凋亡；Bax高表達時，則形成Bax/Bax同源二聚體，促進細胞凋亡[4]。Caspase家族是參與調節和執行凋亡最重要的蛋白酶之一，Caspase-3作為Caspase家族中最重要的成員，是凋亡發生的標志酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，控制著細胞凋亡的發生、發展。劉欣等[5]研究顯示，DM時心肌細胞凋亡增加，Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加。Cai等[6]研究發現，高血糖導致的細胞凋亡至少部分是通過Caspase-3依賴性的線粒體途徑調控的。本實驗發現，DM組大鼠心肌細胞AI明顯增加，Bcl-2蛋白表達減少，Bax、Caspase-3蛋白表達增加，電鏡示心肌超微結構呈明顯損傷性變化，說明DC時細胞凋亡的發生與Bcl-2、Bax表達水平的異常改變及Caspase-3的激活有關，與文獻報道結果一致。Bcl-2表達下調、Bax表達上調所致的Caspase-3依賴性的細胞凋亡可能是DC的發生機制之一。

近年來研究發現，心肌局部腎素-血管緊張素系統（renin angiotensin system，RAS）的過度激活，血管緊張素II（AngII）的異常作用也參與DC細胞凋亡的過程[7]。卡托普利是ACEI類藥，可通過抑制全身或局部的RAS，減少AngII的生物合成而具有抑制細胞凋亡的作用[8]。本實驗觀察到Cap組心肌AI明顯降低，Bcl-2蛋白表達增加，Bax、Caspase-3蛋白表達減少，超微結構損傷不同程度減輕，表明卡托普利可能通過上調Bcl-2表達，下調Bax表達，減少Caspase-3依賴性的心肌細胞凋亡，從而保護DM心肌結構。

綜上所述，卡托普利可以改善DM大鼠高血糖、體質量減輕等癥狀及心肌結構，上調Bcl-2表達，下調Bax表達，減少Caspase-3依賴性的心肌細胞凋亡，為臨床干預DC的發生、發展提供實驗依據。

[1] Cai L, Kang YJ. Cell death and diabetic cardiomyopathy [J].Cardiovasc Toxicol,2003,3(3):219-228.

[2] 張晗,熊世熙,王海蓉,等. 卡托普利與貝那普利對糖尿病大鼠心肌的保護作用[J].心臟雜志,2009,21(6):795-797.

[3] Okoshi K, Guimaraes JF, Di Muzio BP, et al.Diabetic Cardiomyopathy[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2007,51(2):160-167.

[4] Walensky LD. Bcl-2 in the crosshairs:tipping the balance of life and death[J]. Cell Death Differ,2006,13(8):1339-1350.

[5] 劉欣,趙秀蘭,康毅. 糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達研究[J].中國心血管雜志,10(1):4-7.

[6] Cai L, Li W. Hyperglymia-induced apoptosis in mouse myocardium, mitochondrial cytochrome mediated caspase-3 activation pathway[J]. Diabetes,2002,51(6):1938-1948.

[7] Connelly KA, Boyle AJ,Kelly DJ. Angiotensin II and the cardiac complications of diabetes mellitus [J].Currpham Des,2007,13(26):2721-2729.

[8] Zagariya A, Bhat R, Navale S, et al. Inhibition of meconium-induced cytokine expression and cell apoptosis by pretreatment with captopril[J]. Pediatrics,2006,117(5):1722-1727.