人類白細胞抗原-Ⅰ類分子在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義

王星潔 郝迎濤 孫啟峰 趙小剛 彭傳亮 姜興濤 (山東大學第二醫院，山東 濟南 250033)

食管癌是死亡率很高的惡性腫瘤之一，盡管手術水平不斷提高，放療化療設備及藥物不斷更新，食管癌的5年存活率仍較低〔1〕。目前，免疫治療(如應用抗腫瘤T細胞或腫瘤疫苗誘導的抗體治療)越來越受到學者的關注。腫瘤細胞表面HLA-Ⅰ類抗原正常表達并且功能完善，對于細胞毒性T細胞(CTL)為主的細胞免疫，在抗腫瘤機制中發揮起主要作用是極為重要的，而抗原加工呈遞機制(APM)中的重要分子，抗原處理相關轉運蛋白-1(TAP-1)和低分子量蛋白-2(LMP-2)在HLA-Ⅰ分子正常表達中起到重要作用〔2〕。本實驗利用免疫組化染色的方法，研究HLA-Ⅰ類分子在食管鱗癌中的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 60例原發性食管癌標本，均為山東大學第二附屬醫院胸外科1999～2004年手術切除標本，包括周圍正常黏膜上皮，病理結果證實為鱗狀細胞癌，男41例，女19例，年齡42～83歲。常規石蠟包埋，切片，正常組織與腫瘤組織通過HE染色并鏡下觀察證實。按照食管癌病理分期標準對腫瘤進行病理分期，其中高分化22例，中分化13例，低分化25例，淋巴結轉移陽性24例?；颊咝g前均未接受放化療治療。

1.2 主要試劑 單克隆抗體(鼠源性抗體)：EMR8-5(抗HLA-Ⅰ)抗體，工作濃度為1∶100;SY-1(抗LMP2)抗體，工作濃度為1∶200;TO-1(抗 TAP-1)抗體，工作濃度為 1∶100;無關抗體MK2-23，工作濃度1∶100，以上抗體均購自Proteintech公司。通用PV6000 IHC試劑盒(購自北京博樂通生物科技有限公司)：試劑 A，3%H2O2;試劑 B，Polymerized HRP-抗鼠/兔 IgG。

1.3 實驗方法 4～5 μm厚切片脫蠟，加3%H2O2試劑A以滅活內源性過氧化物酶，微波抗原修復，正常馬血清封閉，再依次加一抗、酶二抗聚合物(試劑B)，37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復染，光鏡觀察.用PBS作空白對照，無關抗體MK2-23作陰性對照。

1.4 結果判定 HLA-Ⅰ、TAP-1、LMP-2表達陽性的細胞染為棕黃色或者棕褐色。按照第12屆國際組織相容性大會上確定的統一標準，對石蠟切片染色結果進行判斷：由兩位觀察者分別進行，每張切片隨機選取10個等倍視野(×400)，計數整張切片中著色的癌細胞及癌旁細胞的百分數，按照 ＞75%、75% ～25%、＜25%分別計為陽性、弱陽性和陰性，染色強度分別為強、弱和無，兩種計數結果相加綜合打分為+、±、－。相鄰正常的淋巴細胞和內皮細胞可作為良好的內參來評價染色強度，對角化和壞死的細胞不計數。

1.5 統計學分析 使用SAS18.0軟件對數據進行統計分析，計數資料的分析使用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗，相關性分析使用Spearman相關分析。

2結果

2.1 染色結果 HLA-Ⅰ類分子重鏈表達在細胞膜上，LMP-2及TAP-1表達在細胞質內。見圖1。

圖1 切片免疫組化染色結果(×400)

2.2 HLA-Ⅰ類分子及APM相關分子的表達情況 在正常組織中，這三種分子表達基本正常，僅有1例標本TAP-1分子表達為弱陽性;在食管癌組織中，HLA-Ⅰ類分子及相關分子有明顯表達下調或者缺失，HLA-Ⅰ、TAP-1、LMP-2表達下調的概率分別為23.3%，21.7%，30.0%，表達缺失的概率為35.0%，38.3%，23.3%，見表 1。

2.3 抗原加工呈遞分子與HLA-Ⅰ分子表達情況的關系 對TAP-1及LMP-2分子與HLA-Ⅰ類分子表達情況的關系進行Spearman等級相關分析，結果表明，TAP-1及LMP-2均與HLA-Ⅰ類分子表達異常有關(P＜0.05)，見表2，Spearman相關系數分別為 0.432，0413。

2.4 HLA-Ⅰ相關分子與食管癌患者臨床病理資料的關系

HLA-Ⅰ類分子與腫瘤的分化程度、浸潤深度、病理分期、淋巴結轉移與否有關(P＜0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小無關;TAP-1、LMP-2均與腫瘤分化程度、淋巴結轉移與否有關(P＜0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、病理分期無關。見表3。

表1 正常組織與腫瘤組織HLA-Ⅰ類分子及TAP-1，LMP-2分子陽性表達情況〔n(%)〕

表2 TAP-1及LMP-2分子與HLA-Ⅰ類分子的相關性

表3 HLA與相關分子與食管癌患者臨床病理資料的關系

3討論

HLA-Ⅰ類分子在多種腫瘤細胞中存在表達缺失或下調，并且認為其表達情況與病理學分型、臨床預后具有相關性〔2〕。這種表達異常發生的概率在不同的腫瘤差異較大，約16%～50%〔3〕，如此大幅度的HLA-Ⅰ類抗原表達異常，對機體以細胞毒性T淋巴細胞(CTL)為基礎的抗腫瘤免疫反應是十分不利的，可能是腫瘤實現免疫逃逸的主要原因之一。這種差異產生的原因，一是不同的組織細胞表面HLA-Ⅰ類分子表達情況存在差異，另外與所使用抗HLA-Ⅰ類分子單克隆抗體不一致有關。目前所使用的抗體，例如W6/32，HC-10，或者HC-A2，對腫瘤組織進行染色時，更合適于冰凍切片，而對于甲醛溶液固定，石蠟包埋的組織切片并不是很適合。最近，一種新的針對HLA-Ⅰ重鏈(HLA-A，B，C)的單克隆抗體，EMR8-5，被證明很適合于石蠟切片中HLA-Ⅰ類分子的免疫組化研究〔4〕。我們使用EMR8-5單克隆抗體對HLA-Ⅰ類分子在食管癌中表達情況進行研究，并同時用其他單克隆抗體對 TAP-1，LMP-2〔5，6〕進行研究，評價HLA-Ⅰ類分子表達表達情況，并與臨床資料關系，初步探討APM分子在HLA-Ⅰ類分子表達異常中的作用。

近年來，關于HLA-Ⅰ分子在食管癌中表達情況的研究較少。Rockett等〔7〕通過對37例標本研究發現，HLA-Ⅰ分子表達下調占54%，表達缺失的占41%;Hosch等〔8〕在食管癌的冰凍切片上行研究HLA-Ⅰ分子的分布情況，發現HLA-Ⅰ分子表達異常的概率為45%，并和患者預后、淋巴浸潤呈現正相關;繆鳳琴〔9〕在83例食管癌組織的研究中發現，HLA-Ⅰ分子有明顯的表達下調或缺失，HLA-B/C、HLA-A下調率為12%、25.3%，丟失率為29%、33.7%，并且認為HLA-Ⅰ分子的異常水平與腫瘤分化程度有關。在本實驗中，我們發現，HLA-Ⅰ分子在食管癌原發灶的表達缺失的比例為35.0%，下調的為23.3%，這與既往的結果水平相近，均證明HLA-Ⅰ分子在食管癌中存在明顯的表達異常情況，但由于所使用最新的抗體，得到的結果有一定的差異。結合臨床資料，分化程度低，浸潤深，淋巴結轉移陽性，病理分期低的癌組織，HLA-Ⅰ類分子表達缺失及下調率高，細胞更易于逃避機體的自身免疫監視，導致腫瘤產生與轉移。

LMP-2和TAP-1均是APM中的重要分子。在外科手術切除的多種腫瘤中，TAP-1存在不同程度的表達下降或者缺失，其范圍從14%～49%不等，在體外培養的腫瘤細胞系內，也發現了這種現象〔10〕。另外有學者運用免疫組織化學染色的方法，在頭頸部鱗狀細胞癌的研究中發現，TAP-1表達下調的概率為24%，缺失的概率為28%，LMP-2表達下調的概率為72%，缺失的概率為16%，并且均與臨床不良預后有關〔11〕。本實驗結果TAP-1表達下調的比例為21.7%，缺失的概率為38.3%，LMP-2表達下調的概率為30.0%，缺失的概率為23.0%，這與之前的結果一致，并且TAP-1和LMP-2的表達異常與腫瘤的分化程度與淋巴結浸潤有關，TAP-1及LMP-2可以通過抗原肽的形成異常而導致影響HLA-Ⅰ復合物得形成，運用Spearman相關分析，這兩種分子與HLA-Ⅰ類分子表達異常有關，呈現正相關，我們認為這可能是導致HLA-Ⅰ類分子表達異常的分子機制。

隨著腫瘤免疫逃逸機制研究的深入及腫瘤免疫治療的進一步發展，修復HLA-Ⅰ類分子在腫瘤中的表達，恢復人體自身免疫系統對腫瘤細胞的識別與免疫，可能是未來腫瘤治療的突破口之一。

1 Kleinberg L，Forastiere AA.Chemoradiation in the management of esophageal cancer〔J〕.Clin Oncol，2007;25(26)：4110-7.

2 Hicklin DJ，Marincola FM，Ferrone S.HLA classⅠ antigen downregulation in human cancers：T cell immunotherapy reviewes an old story〔J〕.Mol Med Today，1999;5(4)：178-86.

3 Seliger B.Molecular mechanisms of MHC classⅠabnormalities and APM components in human tumors〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2008;57(11)：1719-26.

4 Kitamura H，Honma I，Toriqoe T，et al.Down-regulation of HLA class I antigen is an independent prognostic factor for clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Urol，2007;177(4)：1269-72.

5 Facoetti A，Nano R，Zelini P，et al.Human leukocyte antigen and antigen processing machinery component defects in astrocytic tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(23)：8304-11.

6 Kloor M，Becker C，Benner A，et al.Immunoselective pressure and human leukocyte antigen class I antigen machinery defects in microsatellite unstable colorectal cancers〔J〕.Cancer Res，2005;65(14)：6418-24.

7 Rockett JC，Damton SJ，Crocker J，et al.Expression of HLA-ABC，HLADR and intercellular adhesion molecule-1 in oesophageal carcinoma〔J〕.Clin Pathol，1995;48(6)：539-44.

8 Hosch SB，Meyer AJ，Schneider C，et al.Expression and prognostic significance of HLA class I，ICAM-1，and tumor-infiltrating lymphocytes in esophageal cancer〔J〕.Gastrointest Surg，1997;1(4)：316-23.

9 繆鳳琴.食管癌組織HLA-Ⅰ類抗原及相關分子的表達及意義〔J〕.南京師大學報(自然科學版)，2004;27(4)：76-9.

10 Johnsen AK.Systemic deficits in transporter for antigen presentation(TAP)-1 or proteasome subunit LMP2 have little or no effect on tumor incidence〔J〕.Int J Cancer，2001;91(3)：366-72.

11 Meissner M.Defects in the human leukocyte antigen class I antigen processing machinery in head and neck squamous cell carcinoma：association with clinical outcome〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(7)：2552-60.