維吾爾族、漢族乳腺癌患者BRCA1基因的表達及差異

傅亞婷 艾秀清 成 芳 (新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，新疆 烏魯木齊 830016)

目前乳腺癌發生、發展的分子機制尚不完全清楚，研究發現乳腺癌發病的病理生理過程是基因累積效應和環境因素共同作用的結果〔1〕。在相同的環境條件下個體的基因背景決定了乳腺癌的易感性〔2〕。目前已發現多種與乳腺癌發病相關的易感基因，其中作為 DNA修復基因的乳腺癌易感基因1(BRCA1)是近年來研究的熱點。相關研究發現BRCA1在癌組織中的表達具有種族差異性〔3〕。故本研究選取新疆地區維吾爾族和漢族乳腺癌患者，觀察BRCA1在癌組織和癌旁組織中的表達及其民族差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 從新疆醫科大學附屬腫瘤醫院組織標本庫選取2010年11月至2011年6月收治的經過臨床病理確診、術前均未經放療和化療、臨床資料完整的女性乳腺癌患者140例，其中維吾爾族、漢族各70例乳腺癌組織及癌旁正常組織標本，用于mRNA檢測。隨機選取維吾爾族27例、漢族27例用于檢測蛋白表達;年齡 26～72歲，平均年齡：維吾爾族(45.81±18.64)歲，漢族(49.37±21.93)歲。乳腺癌組織分級按2003年WHO標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，浸潤性導管癌118例、髓樣癌8例、小葉癌10例、大葉腺癌4例。有淋巴結轉移89例、無淋巴結轉移51例。雌激素受體(ER)陽性88例、ER陰性52例。孕激素受體(PR)陽性97例、PR陰性43例。

1.1.2 一般情況 入組樣本必須滿足維、漢之間在年齡分層、病理分級、腫塊大小、免疫組化情況、淋巴結轉移中的分布無顯著差異，保證入組樣本在維、漢之間的均衡可比性，見表1。

1.1.3 主要試劑與儀器 RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司);RevertAid逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)，PCR即用試劑盒、SYBR實時熒光定量試劑盒、引物合成(大連寶生物工程有限公司)，一抗兔抗-BRCA1/BAP1(北京Bioss公司)，抗β-肌動蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體、羊抗兔二抗、蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、非預染Marker、麗春紅染色試劑(北京康為試劑生物科技有限公司)。icycler型PCR擴增儀、DC2000凝膠成像分析儀、iQ5熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

表1 入組標本一般情況均衡性比較(n=70，n)

1.2 方法

1.2.1 采用SYBR熒光實時定量PCR檢測BRCA1 mRNA在組織中的表達 操作步驟：用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度。采用逆轉錄試劑盒(Fermentas)將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增，具體按操作手冊執行。擴增后，用2%瓊脂糖凝膠，電泳檢測PCR產物。實時定量PCR按照SYBRR PremixExTaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)操作手冊執行。見表2。用β-actin進行內參校正，檢測出的結果是目的基因BRCA1與參照基因β-actin的比值。

表2 各基因的引物序列、PCR產物片段大小和RT-PCR擴增條件

1.2.2 采用Western印跡技術檢測BRCA1在組織中的蛋白表達 蛋白提取液按1∶99加蛋白酶抑制劑混勻，按1∶10(g/ml)加樣品中勻漿后提取總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒進行蛋白定量。配制8%的分離膠，5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用半干法按照電流1.2 mA/cm2膜面積，恒流轉膜。轉膜后麗春紅染色試劑染色，觀察轉膜效果。5%脫脂奶粉〔Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶解的，pH7.5〕室溫封閉1 h。封閉液稀釋一抗，室溫孵育30 min，4℃過夜。TBST洗膜后用Western印跡 封閉液Ⅱ稀釋二抗，室溫40 min。TBST洗膜后用ECL發光試劑盒進行檢測。使用DNR熒光凝膠成像系統Micro Chemi曝光成像。顯影結果使用ImageJ軟件進行分析處理，結果用相對光密度值(ROD)×面積(mm2)表示。BRCA1蛋白的相對含量用(目的條帶的ROD×mm2)/(β-actin條帶的ROD×mm2)表示。

1.3 統計學方法 用SPSS17.0統計軟件進行分析，所有數據均進行正態性檢驗，計量資料以x±s表示，癌與癌旁的比較采用配對t檢驗，兩民族間比較采用成組t檢驗。

2結果

2.1 實時熒光定量檢測乳腺癌組織及癌旁組織中BRCA1 mRNA的表達 維吾爾族、漢族乳腺癌組織中BRCA1 mRNA表達均低于相應癌旁組織(P＜0.05)，見圖1、表3。維吾爾族乳腺癌組織較癌旁組織BRCA1 mRNA表達降低的幅度(－0.756±0.239)高于漢族(－0.255±0.075)(P＜0.05)。

圖1BRCA1 mRNA基因擴增電泳圖

2.2 Western印跡法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中BRCA1蛋白表達 維吾爾族、漢族乳腺癌組織中BRCA1蛋白表達均低于相應癌旁組織(P＜0.05)。見圖2，表4。維吾爾族乳腺癌組織較癌旁組織BRCA1蛋白表達降低的幅度(－4.282±0.278)明顯高于漢族(－1.901±0.278)(P＜0.05)。

表3 BRCA1 mRNA在乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的表達(x±s)

表4 BRCA1蛋白在乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的表達(x±s)

圖2 BRCA1蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織的表達

3討論

BRCA1是與乳腺癌發生相關的DNA修復基因，在損傷修復、轉錄調控、細胞周期調控中發揮重要作用〔4〕。乳腺組織中BRCA1表達缺失可促進乳腺癌的發生。研究表明，BRCA1 mRNA在乳腺癌組織中表達下降，并且與預后相關〔5〕。Marcus等〔6〕研究發現，美國女性散發性乳腺癌中，癌細胞與正常上皮細胞相比較，癌細胞中BRCA1表達減少，且BRCA1的減少與潛在高惡性有顯著聯系。BRCA1基因在轉錄水平和翻譯水平的表達有一致性，腫瘤發生時出現mRNA轉錄水平的下調，導致轉錄水平的蛋白表達下降。故認為癌組織中BRCA1的表達降低與乳腺癌的發生密切相關。

李鴻濤等〔7〕檢測維吾爾族女性乳腺癌組織中BRCA1失表達率為37.9%，根據研究顯示維吾爾組BRCA1表達陽性率明顯高于漢族女性組，提示維、漢女性散發性乳腺癌組織BRCA1的陽性表達可能存在種族差異;維吾爾族散發性乳腺癌組BRCA1表達低于維吾爾族乳腺纖維瘤組，提示BRCA1蛋白的失表達或低表達和新疆維吾爾族散發性乳腺癌的發生有關。本研究發現維吾爾族乳腺癌組織與癌旁組織BRCA1基因表達降低的幅度明顯高于漢族，維、漢之間差異有統計學意義。認為種族遺傳背景可能成為影響BRCA1基因表達的因素，維吾爾族可能更容易發生乳腺癌易感基因表達的降低或缺失，本文推測BRCA1基因可能在維吾爾族的遺傳背景下有其獨特的腫瘤學行為，BRCA1基因表達缺失或表達降低有可能與維吾爾族乳腺癌的發生關系更為密切。

作為重要的DNA修復基因，BRCA1等基因在轉錄水平和翻譯水平表達的改變在不同程度上影響了乳腺癌的發生，并表現出種族差異。后續的研究中課題組將加大樣本量，對BRCA1基因與維、漢乳腺癌的關系做進一步的分析。

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2 Poplawski AB，Jankowski M，Erickson SW，et al.Frequent genetic differences between matched primary and metastatic breast cancer provide an approach to identification of biomarkers for disease progression〔J〕.Eur J Hum Genet，2010;18(5)：560-8.

3 Perry CS，Oterc JC，Palmer JL，et al.Risk factors for breast cancer in East Asian women relative to women in the West〔J〕.Asia Pacific J Clin Oncol，2009;5(4)：219-31.

4 Turner NC，Reis Filho JS，Russell AM，et al.BRCA1 dysfunction in sporadic basal like breast cancer〔J〕.Oncogene，2007;26(14)：2126-32.

5 Margeli M，Cirauqui B，Castella E，et al.The prognostic value of BRCA1 mRNA expression levels following neoadjuvant chemotherapy in breast cancer〔J〕.PLoS One，2010;5(3)：9499.

6 Marcus JN，Watson P，Page DL，et al.Hereditary breast cancer：pathobiology，prognosis，and BRCA1 and BRCA2 gene linkage〔J〕.Cancer，1996;77(4)：697-709.

7 李鴻濤，阿力比亞提·艾馬，馬斌林，等.新疆維吾爾族女性散發性乳腺癌組織中BRCA1、C-erBb-2的表達分析及其臨床意義〔J〕.中國癌癥雜志，2010;20(9)：658-62.