食管癌組織中人乳頭瘤病毒16型整合狀態的檢測

張 科 李淑英 丁廣成 趙 瑩 劉文博 張云茹

(河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

人乳頭瘤病毒(HPV)屬DNA病毒，與許多部位鱗狀上皮細胞良性及惡性腫瘤性病變有關，其中HPV感染與宮頸癌的相關性已得到公認。研究顯示，食管癌組織中有HPV基因存在。病毒整合是惡性進展的一個標志，大部分腫瘤含一些整合的HPV拷貝〔1～3〕，HPV整合常引起HPV E2閱讀框架(ORF)的斷裂或缺失，使E6和E7表達升高，有利于惡性轉化。為進一步探討HPV感染與食管癌發生的相關性，本研究應用實時熒光PCR擴增，檢測了食管癌患者組織標本中HPV的整合狀態及病毒載量。

1 材料與方法

1.1 材料 河南省林州市食管癌患者手術切除組織標本55例，男21例，女34例，平均年齡為58(46～68)歲。組織切除后立即放入－70℃冰箱保存。293細胞DNA作為內參的陽性對照;含有HPV16E2基因質粒、HPV16 E6-E7質粒及β-actin質粒本室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 本研究中應用實時熒光PCR的原理是依據下列假設：HPV整合時最常缺失的E2開放閱讀框(ORF)的特殊區域，如HPV以游離型形式存在，E2與 E6拷貝數比例相等;如HPV整合在宿主染色體中，E2缺失，E2與 E6拷貝數比例為零;如HPV以游離、整合的混合型形式存在，E2的拷貝數少于E6。E2與E6比率代表HPV整合狀態。因此，根據GenBank提供的基因序列設計引物，選擇HPV16三個E2基因區和一個E6基因區位點設計HPV16E2和E6引物及β-actin引物(如表1)。委托上海生工合成引物。

1.2.2 組織標本中DNA的提取及質量控制 使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德國)，按說明書指示，食管癌組織標本經液氮冷凍研磨后，提取組織DNA于-－0℃保存。使用β-Actin作內參進行PCR擴增檢測所提DNA的質量。PCR中使用了 Ex-Taq(寶生物，大連)，每個反應總體積為25 μl，加入0.5 μl提取的DNA為模板，以293細胞DNA(或β-Actin質粒)為陽性對照。反應條件：95℃預變性5 min，循環參數95℃/1 min，55℃ /1 min，72℃ /1 min，5 個循環;95℃ /20 s，55℃ /30 s，72℃ /30 s，40個循環;72℃延伸5 min;4℃保存。

表1 實時熒光PCR的引物序列及大小

1.2.3 熒光定量PCR檢測組織標本中HPV16、病毒載量及整合狀態 用上述表1的引物。EvaGreen熒光染料，在Rotor Gene熒光PCR系統進行PCR擴增，用每套引物將六個梯度的質粒和每一例待檢樣品平行分析三次。首先，用HPV16E6型特異性引物檢測HPV16;第二，β-actin引物檢測其含量;第三，用HPV16E2引物進行檢測。PCR反應體系(25 μl)：1×Ampli-Taq Gold Buffer(MgCl2free)，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L 混合 dNTPs，2 pmol/L 引物，1.25 μl 20 × EvaGreen，0.25 μl Rx，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，加入0.5 μl癌組織標本DNA作為模板，加雙蒸水至25 μl，進行熒光定量PCR擴增。反應中，用雙蒸水作為陰性對照，用六個稀釋梯度的質粒作為陽性對照。病毒載量(copies/cell)由下列公式計算：(E6copy/β-actincopy)×2，其結果為每個細胞中HPV16的拷貝數;整合狀態由E2與E6的拷貝數的比值決定。

2結果

2.1 實時熒光PCR進行HPV16、病毒載量及整合狀態分析

依據標準曲線得到每一待檢標本的β-actin、E2、E6基因的拷貝數。每1例標本用每對引物平行分析三次，取三次平行分析結果的平均值，結果55例標本中檢測到32例標本陽性，其陽性率為58.2%;每例樣品所含有HPV16的病毒載量為0.066～65.2拷貝(如表2)。

表2 32例HPV16陽性樣品中的病毒載量及HPV16的整合狀態

2.2 標本DNA的提取和質量控制 依據所提取標本DNA的電泳條帶，說明DNA濃度比較均一如圖1A。以293細胞DNA為模板的陽性對照，其PCR產物為290 bp，55例標本DNA經內參β-actin擴增后得到與陽性對照相一致的電泳條帶，如圖1B。說明所提標本DNA都能滿足進一步的實驗要求。

依據E2與 E6的比值，確定HPV16的整合狀態。32例HPV16陽性標本中，檢測到有2例(6.3%)標本E2基因沒被破壞，E2與E6的比值大于一，HPV16呈游離狀態;3例沒有檢測到E2基因，9.4% 是完全整合狀態，E2與E6的比值等于零;27例檢測到E2與E6的比值大于零而小于一，84.4% 既有整合又有游離的病毒存在;并且在游離與整合的混合型中，有21例整合型多于游離型(表2)。提示32例HPV16陽性食管癌樣品中，病毒DNA與宿主基因整合很普遍。

圖1 食管癌樣品中DNA質量檢測

3討論

實時熒光定量PCR技術檢測病毒存在狀態的原理：HPV整合時，E2中心區域“絞鏈區”因其不穩定性而成為HPV整合入宿主細胞最常見的HPV缺失或斷裂部位，而E6和E7 ORF及長控區(LCR)常保持完整〔4〕。因此，在設計引物時，選擇HPV16 E2區的三個不同部位設計引物，即HPV16 E2起始區2 755～2 942，“絞鏈區”3 355～3 526，接近終點區3 602～3 786區設計引物，這樣設計的引物可真實地反映HPV16的缺失或斷裂部位，從而可真實地反映整合狀態。根據這一原理，如HPV以游離型形式存在，E2與E6拷貝數比例相等;如HPV整合型在宿主染色體中，E2缺失，E2與 E6拷貝數比例為零;如HPV以游離和整合的混合型形式存在，E2的拷貝數少于E6。E2與E6比率代表HPV整合狀態。因此，可通過E2/E6比值觀察HPV基因組在宿主染色體上的整合情況。在本項研究中，為使E2與E6的比率準確的反映HPV的整合狀態，我們在設計E2的引物時，分別選擇了三個不同的區域，即E2基因的兩端和中心區域。

我們用含有看家基因β-actin、HPV16 E2全長及E6～E7的質粒為標準品，進行β-actin、HPV E2及E6基因的定量。結果顯示，三條標準曲線相關系數均大于0.95，表明標準曲線相關性好，符合標準曲線定量法的要求。因而，我們能夠對HPV16 E2和E6基因進行準確的定量。

通過實時熒光PCR檢測人看家基因β-actin含量，及每例樣品中E6含量，可估測出HPV的病毒載量(包括游離和整合)。通過計算每例標本HPV16E6的拷貝數與β-actin的拷貝數之比，計算得到HPV16的拷貝數。32例樣品中，大約每個細胞含有0.066～65.2拷貝數。這一范圍的病毒載量與宮頸上皮內瘤變病毒載量(每個細胞大于8 000拷貝)〔5〕相比，顯然是很低的，因而需用較靈敏的方法才能檢測到。

雖然在宮頸上皮瘤變中，瘤變的進程與HPV整合到宿主染色體的病毒載量相關〔6〕，但在一些HPV陽性的宮頸癌細胞系中，有較低的病毒載量，如SiHa細胞系中，每個細胞中HPV16的拷貝數為1～2拷貝〔7〕，HeLa細胞系中，每個細胞中HPV18的拷貝數為10～50拷貝〔8〕。結合我們研究的結果，推測在一些食管癌中雖然病毒載量較低，但當病毒與宿主基因組整合后，改變了其他基因的結構與功能，低病毒載量仍可導致或促進腫瘤的發生。

本研究提示在食管癌組織中，HPV16大多以游離和整合的混合形式存在，但整合型所占比例多于游離型。Si等〔8〕用熒光PCR方法研究了35例HPV16陽性標本的整合狀態，其結果表明，2例為完全整合、3例為完全游離、30例為游離和整合同時存在。提示在食管癌組織標本中HPV DNA與宿主細胞基因的整合很普遍。這些結果進一步說明，HPV感染可能是食管癌發生的重要危險因子，食管癌發生與HPV感染有關。

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3 Wilke CM，Hall BK，Hoge A，et al.FRA3B extends over a broad region and contains a spontaneous HPV16 integration site：direct evidence for the coincidence of viral integration sites and fragile sites〔J〕.Hum Mol Genet，1996;5(2)：187-95.

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6 Peitsaro P，Johansson B，Syrjanen S.Human papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique〔J〕.J Clin Microbiol，2002;40(3)：886-91.

7 Hugo AP，Peyton CL，Joste NE，et al.Human papillomavirus type 16 integration in cervical cancer〔J〕.JCM，2006;44(5)：1755-62.

8 Si HX，Tsao SW，Poon CSP，et al.Physical status of HPV16 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Clin Virol，2005;32(1)：19-23.