FKHRL-1基因轉染對血管損傷后平滑肌細胞增殖能力的影響

孫 贇 蔡文瑋 胡 萍 (上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院老年病科，上海 200011)

經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)術廣泛開展的重要因素之一〔1〕，尤其是許多亞組患者，如糖尿病或小血管彌漫性病變，發生率更高。血管平滑肌細胞(VSMC)過度增生所致的新生內膜增厚，是造成PTCA術后血管再狹窄的主要原因〔2〕。Forkhead家族具有一個高度保守的DNA結構域，自1989年首次被發現以來，這一新興的轉錄因子家族已經有了19個亞家族，表現出生物活性的高度多樣性，其家族成員FKHRL-1(FoxO3a)，更是廣泛表達于多個組織器官中，在細胞發育、代謝、凋亡及癌變過程中起著關鍵性的調控作用。本研究探討FKHRL-1基因轉染對VSMC增殖能力的影響，為基因治療PTCA術后再狹窄在實際中的應用提供一種可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，雄性，體質量280～320 g;動物生產許可證號為SCXK(滬)2007-2005，使用許可證號為SYXK(滬)2007-2007。其中，先取21只SD大鼠分成對照組(C1組，n=3)和球囊損傷組(S組，n=18)，其中球囊損傷組又分為：損傷后0.5 h(S1組，n=3)、1 h(S2 組，n=3)、2 h(S3 組，n=3)、3 h(S4 組，n=3)、6 h(S5組，n=3)和12 h(S6組，n=3)。再取15只SD大鼠，完成頸總動脈球囊損傷建模后、以損傷后2 h為時間截點，隨機分為3組：正常對照組(C2組，n=5)、空白對照組(N組，n=5)和體外轉染組(T組，n=5)。

1.2 主要儀器與試劑 2F動脈取血栓導管(120602F，愛德華生命科學有限公司);DMEM培養液(Hyclone);0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco);胎牛血清(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO)、MTT(Sigma);FoxO3a抗體、p-FoxO3a抗體、HA-Tag兔抗單克隆抗體(CST);PCR引物(上海英維捷基貿易有限公司);質粒HA-FoxO3a TM(Addgene、質粒號1788)(圖1);QIAGEN plasmid mini kit(Qiagen、貨號12125);脂質體LipofectAMINETM2000由上海交通大學附屬第九人民醫院組織工程重點實驗室提供。

圖1HA-FoxO3a TM質粒圖譜

1.3 建立頸動脈球囊損傷模型 SD大鼠(按照0.3 ml/100 g體重腹腔內注射10%水合氯醛)麻醉后，將其固定于手術臺上，常規消毒頸部皮膚、備皮、鋪巾，取頸部正中切口，逐層分離軟組織、暴露頸總動脈，用止血鉗鈍性分離左側頸總動脈、左頸內、外動脈及迷走神經，頸總動脈近心端與頸內動脈分叉處遠心端分別活結結扎，頸外動脈分叉處遠心端死結結扎。用顯微外科剪在頸外動脈分叉處與結扎處之間剪一“V”型切口，從左側頸外動脈置入2F取栓導管至左側頸總動脈結扎處，于球囊內注入0.9%生理鹽水以擴張球囊，并向遠心端牽拉導管以剝脫內膜，抽去生理鹽水后送回頸總動脈內。重復上述操作3次后，退出導管，于頸外動脈分叉處和切口之間結扎，松開頸總動脈和頸內動脈的活結，待血供恢復后，逐層縫合傷口，繼續以標準飼料按照清潔級動物飼養。

1.4 VSMC的培養和鑒定 取正常的和損傷后的頸總動脈血管組織，以組織塊貼壁法培養VSMC，原代細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，取第3代細胞用于實驗。以免疫組織化學方法、采用來源于平滑肌細胞的特異性SMα-actin抗體，鑒定血管平滑肌細胞。

1.5 RT-PCR檢測FKHRL-1 mRNA的表達 收集C1組和S組不同損傷時間點的VSMC，TRIzol試劑提取細胞總RNA，將逆轉錄產物cDNA進行Real-time PCR反應。PCR引物由上海英維捷基貿易有限公司合成，引物序列：5'-TGCTCACTTCGGACTCGC-3'(上游)、5'-GACATCATTGGGTCGTTGC-3'(下游)，產物長度為136 bp。內參β-actin引物由上海交通大學附屬第九人民醫院組織工程國家重點實驗室提供，產物長度為592 bp。RT-PCR反應條件：95℃預變性5 min、95℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸45 s、35個循環后延伸5 min。PCR產物經1.8%瓊脂凝膠電泳2 h后，凝膠成像系統進行觀察分析。1.6 Western印跡檢測FKHRL-1總蛋白及其磷酸化蛋白的表達 取不同時間點VSMC，分別加入100 μl組織裂解液(Sigma)和3 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)制成勻漿，提取蛋白并檢測蛋白濃度。10%分離膠上樣10 μl蛋白樣品，80V電泳、繼之400 mA轉膜 2 h，5%TBST封閉過夜;一抗(FoxO3a抗體，1∶1 000;p-FoxO3a 抗體，1∶800)過夜，洗滌后加二抗(1∶2 000);曝光、顯影。

1.7 VSMC的轉染①取球囊損傷后2 h的第3代VSMC，于轉染前24小時胰酶消化制成細胞懸液、接種于6孔細胞培養板上(每孔含1×105/2 ml細胞懸液);細胞分三組(6孔板，每組樣本n=3)，C2組(損傷后VSMC不予干預，未轉染質粒)、N組(陰性轉染質粒 pECE-GFP(－)、T組(轉染質粒 HA-FoxO3a TM)。②首先使用Lipofectmaine2000脂質體分別對質粒pECEGFP(－)和質粒 HA-FoxO3a TM進行包裹，充分混勻、靜置20 min以便形成復合物，后分別加入N組和T組細胞中、轉染VSMCs;待6孔板中溶液分布均勻，將細胞重新放回恒溫培養箱內培養;倒置顯微鏡下觀察，若VSMC內出現脂質體空泡，說明轉染完成。③轉染后24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率，并對細胞進行換液(DMEM+10%FBS)、繼續培養;轉染后48 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率。Western印跡檢測轉染后VSMC中質粒蛋白的表達 取轉染后各組的VSMC，具體步驟同前，一抗(HA-Tag，1∶1 000)、二抗(1∶2 000)。

1.8 MTT法檢測轉染后細胞的增殖能力 取轉染后C2組、N組和T組的損傷后VSMC，于培養后5 d內每日檢測VSMC的增殖能力，每個時間點設4個復空。吸棄原培養液，每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20 μl，置于培養箱內孵育4 h后，小心吸盡上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min以溶解結晶。以酶標儀測定在570 nm波長的光密度(以無細胞生長的培養液作為調零)。

1.9 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗。

2結果

2.1 VSMC的鑒定及FKHRL-1 mRNA的表達 經來源于平滑肌細胞的特異性 SMα-actin鑒定，明確為 VSMC(圖2)。RTPCR 檢測結果顯示，在 C1、S1、S2、S3、S4、S5、S6 組中均可見FKHRL-1 mRNA的表達，約136 bp(圖3)。

圖2 VSMC鑒定(×100)

圖3RT-PCR檢測VSMC中FKHRL-1 mRNA的表達

2.2 VSMC FKHRL-1總蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平

Western印跡檢測結果顯示，在 C1、S1～6各組中均可見FKHRL-1總蛋白表達，且S3組可見FKHRL-1磷酸化蛋白的明顯表達。其中，各S組與C1組在FKHRL-1總蛋白表達水平上比較無統計學意義(P＞0.05);在各S組中，損傷后S1組和S2組中FKHRL-1磷酸化蛋白的表達呈現上升趨勢，直至S3組(損傷后2 h)可見FKHRL-1磷酸化蛋白表達達到高峰，與其他組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，而在S4組、S5組中FKHRL-1磷酸化蛋白水平呈逐漸下降趨勢，至S6組中磷酸化蛋白則呈低表達見圖4，表1。

2.3 VSMC轉染效果檢測

表1 Western印跡檢測VSMC中FKHRL-1總蛋白及磷酸化蛋白的表達

2.3.1 熒光倒置顯微鏡下觀察 轉染后N組中VSMC生長形態良好，細胞內可見綠色熒光分布，且隨著轉染后細胞培養時間的延長，綠色熒光分布逐漸密集，證明攜帶有基因GFP的空載質粒成功轉染入VSMC內，并表達綠色熒光蛋白(圖5)。

圖4Western印跡檢測VSMC FKHRL-1總蛋白及磷酸化蛋白的表達

圖5 空白對照組轉染后VSMC形態(×200)

2.3.2 轉染后VSMC中質粒蛋白的表達水平 在正常對照組(C2組，0.002)和空白對照組 (N組，0.004)的VSMC中，質粒HA-FoxO3a TM的標記蛋白HA-Tag呈現極低表達;而在體外轉染組 (T組，0.642)中，可見標記蛋白HA明顯表達增強，與C組、N組之間存在顯著性差異 (P＜0.01)，提示脂質體成功將帶有HA-FoxO3a TM基因片段的質粒轉染入VSMC中(圖6)。

圖6 轉染后質粒蛋白的表達

2.3.3 FKHRL-1轉染對VSMC增殖能力的影響 應用MTT法比較各組間VSMC的增殖能力，與正常對照組(C2組)相比，體外轉染組(T組)VSMC的OD值明顯降低，提示轉染前后VSMC增殖能力的變化差異具有統計學意義(P＜0.01);而空白對照組(N組)與正常對照組(C2組)之間，VSMC的增殖能力比較沒有統計學意義，見表2。

表2 各組間VSMC增殖能力比較

3討論

隨著對再狹窄分子生物學機制的認識與研究的深入，以及分子生物學技術的發展，越來越多的轉錄調節基因被發現參與到VSMC的增殖過程中。通過阻斷上述基因的表達以抑制VSMC的增殖、減輕內膜的增生〔3〕，成為了未來解決再狹窄問題的突破點之一。

所謂基因治療，就是應用基因工程和細胞生物學技術，將功能正常的基因轉移到靶細胞中，通過導入的基因表達，使得靶細胞獲得特定的功能、補充丟失或缺失的正常功能蛋白質、或者抑制體內基因的過盛表達，從而達到治療目的。傳統意義上的基因治療是指外源基因導入受體細胞后，與細胞染色體基因組發生整合，成為宿主細胞遺傳物質的一部分，外源基因表達產物起到對疾病的防治作用。近年來，隨著基因轉移技術的發展，外源基因導入后并不發生整合，而在染色體外表達基因產物，或者僅僅導入反義核苷酸抑制特定基因的表達，同樣能發揮治療效果。

基因治療的關鍵和基礎就是基因轉染，使其能夠安全、真實、長效地表達。通常基因轉染的載體可分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。腺病毒載體由于其轉染能力強曾被廣泛應用，但由于轉染時可以復原為致病性的野生型腺病毒、具有細胞毒性和免疫原性，實際應用受到許多限制〔4〕。非病毒載體，如陽離子脂質體、陽離子類脂質體和聚合物等，具有許多優勢，如價格低廉、無致炎性和免疫原性、良好的生物相容性、安全性高、重復性好。近年來研發的陽離子脂質體(如本實驗選用的Lipofectamin 2000)，對基因片段代謝大小限制較少、轉染過程相對無害，當它與質粒DNA混合后即可自動形成包裹DNA的脂質體顆粒，通過細胞內吞作用轉移至細胞內。本實驗選擇上述陽離子脂質體為載體，將目的基因(HA-FoxO3a TM)轉染至體外培養的球囊損傷后VSMC中。轉染治療后通過Western印跡法檢測質粒DNA標記蛋白的表達，以及熒光顯微鏡下觀察到陰性轉染后VSMC內的大量綠色熒光分布、而正常對照組中均未見綠色熒光分布和蛋白表達，提示脂質體包裹質粒的轉染方式成功。

研究證實〔5〕，FKHRL-1可使細胞周期停滯在G1-S和G2-M期“限制點”，抑制細胞生長，具有上游調控作用并且在分化晚期調控基因表達，還可使細胞對凋亡刺激敏感性增強。同時人們提出，FKHRL-1的上游活性通路是一個磷酸化與乙酰化的雙重調節機制。目前認為，FKHRL-1的磷酸化修飾是該轉錄因子最常見、最重要的上游調控通路，哺乳動物體內存在著多條信號通路共同發揮著上述作用，促使FKHRL-1磷酸化而發生核排斥、滯留于細胞質中，從而活性受到抑制。我們在前期的研究中也發現〔6〕，血管損傷后，血管平滑肌細胞內FKHRL-1快速發生磷酸化且持續時間短，磷酸化的高峰在損傷后12 h內出現，并伴隨血管平滑肌細胞增殖能力的顯著升高。

本實驗結果一方面提示非磷酸化FKHRL-1的含量升高可能在抑制VSMC增殖過程中發揮作用;另一方面也提示通過基因轉染方式抑制血管損傷后修復過程的可行性。

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2 Horlitz M，Sigwart U，Niebauer J.Fighting restenosis after coronary angioplasty：contemporary and future treatment options〔J〕.Int J Cardiol，2002;83(3)：199-205.

3 Guard N，Mangement C，Bertrand P，et al.Ilyaluneetines secretion by monocytes：downregulation by IL-13 upregulation by IL-10〔J〕.Cytokine，1999;11(4)：579-84.

4 Verma IM，Somia N.Gene therapy-promises，problems and prospects〔J〕.Nature，1997;389(6648)：239-42.

5 Jacobs FM，van der Heide LP，Wijchers PJ，et al.FoxO6，a novel member of the FoxO class of transcription factors with distinct shuttling dynamics〔J〕.Biol Chem，2003;278(38)：35959-67.

6 孫 贇，盛 凈，胡 萍，等.轉錄因子FoxO3a磷酸化對血管平滑肌細胞增殖能力的影響〔J〕.上海交通大學學報(醫學版)，2011;31(4)：429-33.